mesЭкстремальная биомедицинаExtreme Medicine3033-89643033-8972Centre for Strategic Planning of the Federal Medical and Biological Agency10.47183/mes.2024-26-4-141-148mes-232Research ArticleГЕМАТОЛОГИЯНEMATOLOGYИспользование лактулозы в составе криоконсерванта для сохранения клеток кровиUse of lactulose in the composition of blood cell cryopreservativeshttps://orcid.org/0000-0002-4598-8994ВласовА. А.VlasovA. A.

Власов Александр Александрович, канд. мед. наук

Ставрополь

Stavropol

alecs-aspirini@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9588-6902АндрусенкоС. Ф.AndrusenkoS. F.

Андрусенко Светлана Федоровна, канд. биол. наук, доцент

Ставрополь

Stavropol

svet1677@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6629-5647АнфиногеноваО. И.AnfinogenovaO. I.

Анфиногенова Оксана Ивановна, канд. биол. наук, доцент

Ставрополь

Stavropol

zaxana@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8707-515XЭлькановаА. Б.ElkanovaA. B.

Эльканова Айшат Борисовна, канд. мед. наук

Ставрополь

Stavropol

aishat.elkanowa@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1517-345XКадановаА. А.KadanovaA. A.

Каданова Анна Анатольевна

Ставрополь

Stavropol

varnina82@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0000-4336-4021СорокинаУ. Е.SorokinaU. E.

Сорокина Ульяна Евгеньевна

Ставрополь

Stavropol

ulianasorokina100920@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0000-0865-2554РыбчинскаяЭ. Е.RybchinskayaE. E.

Рыбчинская Эльвира Евгеньевна

Ставрополь

Stavropol

rybchinskaya_elvira@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4022-5020ДоменюкД. А.DomenyukD. A.

Доменюк Дмитрий Анатольевич, д-р. мед. наук, профессор

Ставрополь

Stavropol

Северо-Кавказский федеральный университетРоссияNorth-Caucasus Federal UniversityRussian FederationСтавропольский государственный медицинский университетРоссияStavropol State Medical UniversityRussian Federation202410112024264141148Copyright © Власов А.А., Андрусенко С.Ф., Анфиногенова О.И., Эльканова А.Б., Каданова А.А., Сорокина У.Е., Рыбчинская Э.Е., Доменюк Д.А., 20242024Власов А.А., Андрусенко С.Ф., Анфиногенова О.И., Эльканова А.Б., Каданова А.А., Сорокина У.Е., Рыбчинская Э.Е., Доменюк Д.А.Vlasov A.A., Andrusenko S.F., Anfinogenova O.I., Elkanova A.B., Kadanova A.A., Sorokina U.E., Rybchinskaya E.E., Domenyuk D.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.extrememedicine.ru/jour/article/view/232Введение

Введение. Криоконсервация позволяет длительно сохранять биоматериал, однако существует ряд проблем, связанных с недостаточной эффективностью криоконсервантов и токсичностью ряда криокомпонентов, в связи с чем актуален поиск низкотоксичных биосовместимых криоагентов.

Цель

Цель. Оценка морфофункциональных особенностей форменных элементов крови в криоконсерванте с лактулозой на основании показателей лейкоцитарных, тромбоцитарных и эритроцитарных параметров для хранения цельной крови при умеренно низкой температуре (–20 С).

Материалы и методы

Материалы и методы. Исследование проведено на 30 добровольцах-донорах женского пола в возрасте 18–23 лет. Объект исследования — периферическая венозная кровь, стабилизированная 3-замещенной калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты. При приготовлении модельного криоконсерванта был использован 0,9 % раствор хлорида натрия для поддержания изотонической концентрации. В качестве криопротекторов, проникающих в клетку, использовали глицерин и диметилсульфоксид, в качестве не проникающего — дисахарид лактулозу. Оптимизация состава криоконсерванта проводилась за счет варьирования массовых долей компонентов. Общий анализ крови выполняли на автоматическом гематологическом анализаторе «Гемалайт 1270». Компьютерное цитоморфометрическое исследование проводили на аппаратно-программном комплексе «МЕКОС-Ц2».

Результаты

Результаты. В ходе исследования в условиях сохранения образцов крови с применением разработанного криоконсерванта после 24 ч хранения при температуре –20 С увеличивался процент сохранности лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов (88,6 ± 0,41, 92,1 ± 0,31, 91,4 ± 0,52% соответственно) с сохранением форменных элементов крови в физиологически активном состоянии после оттаивания по сравнению с образцами крови, сохранявшимися при комнатной температуре.

Выводы

Выводы. Выявлена морфологическая и функциональная сохранность форменных элементов крови в образцах с применением разработанного криоконсерванта после 24 ч хранения при температуре –20 °С. Преимущества данного криоконсерванта: возможность его длительного хранения без потери криопротекторных свойств, обеспечение криопротектором стабилизации форменных элементов крови к воздействию субумеренно низкой температуры –20 °С, применение нетоксичного дисахарида лактулозы, не проникающего внутрь клетки. Разработанный криоконсервант является эффективным в условиях замораживания при –20 °С и доступным (все компоненты производятся на территории Российской Федерации). Исследования в данном направлении позволят более эффективно использовать аутодонорство во избежание ряда осложнений при трансфузии компонентов крови.

Introduction

Introduction. Cryopreservation allows for long-term conservation of biomaterials. The insufficient efficacy of available cryopreservatives and the toxicity of a number of cryocomponents renders the search for low-toxic biocompatible cryoagents highly relevant.

Objective

Objective. Assessment of morphological and functional features of blood cells in a lactulose-based cryopreservative for storing whole blood at moderately low temperatures (minus 20 °C) using leukocyte, platelet, and erythrocytes parameters.

Materials and methods

Materials and methods. The study was conducted using peripheral venous blood of 30 female donor volunteers aged 18–23 years. Samples of peripheral venous blood were stabilized by 3-substituted potassium salt of ethylenediaminetetraacetic acid. The cryopreservative was prepared using a 0.9 % sodium chloride solution to maintain the isotonic concentration. Glycerin and dimethyl sulfoxide were used as cell-penetrating cryoprotectors; lactulose disaccharide was used as a non-penetrating cryoprotector. The composition of the obtained cryopreservative was optimized by varying the mass fractions of the components. Clinical blood tests were performed using a Gemalite 1270 automatic hematology analyzer. A computer cytomorphometric study was performed in the MEKOS-C2 hardware and software environment.

Results

Results. The conservation of blood samples using the developed cryopreservative for 24 h at a temperature of minus 20 °C increased the percentage of preserved leukocytes, erythrocytes, and platelets to 88.6±0.41 %, 92.1±0.31 %, and 91.4±0.52 %, respectively. The blood cells retained their physiological activity after thawing compared to blood samples stored at room temperature.

Conclusions

Conclusions. The morphological and functional safety of blood cells in samples stored with the developed cryopreservative was revealed after 24 h of storage at minus 20°C. The advantages of this cryopreservative include the possibility of its long-term storage without loss of cryoprotective properties, stabilizing blood cells to the effects of sub-moderate low temperatures of minus 20 °C, the use of non-toxic lactulose disaccharide that does not penetrate into the cell. The developed cryopreservative proves effective in freezing conditions at minus 20 °C, being affordable in terms of cost (all components are manufactured in the Russian Federation). Further research in this direction will contribute to the development of safer blood donation approaches and reducing complications during transfusion of blood components.

криоконсервациякриопротекторыэритроцитылейкоцитытромбоцитылактулозаморфофункциональные свойстваcryopreservationcryoprotectorserythrocytesleukocytesplateletslactulosemorphofunctional propertiesИсследование не имело спонсорской поддержки.The study was performed without sponsorshipReferencesHidi L, Komorowicz E, Kovács GI, Szeberin Z, Garbaisz D, Nikolova N, et al. Cryopreservation moderates the thrombogenicity of arterial allografts during storage. PLoS One. 2021;16(7): e0255114. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0255114Hidi L, Komorowicz E, Kovács GI, Szeberin Z, Garbaisz D, Nikolova N, et al. Cryopreservation moderates the thrombogenicity of arterial allografts during storage. PLoS One. 2021;16(7): e0255114. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0255114Bojic S, Murray A, Bentley BL, Spindler R, Pawlik P, Cordeiro JL, et al. Winter is coming: the future of cryopreservation. BMC Biol. 2021;19(1):56. https://doi.org/10.1186/s12915-021-00976-8Bojic S, Murray A, Bentley BL, Spindler R, Pawlik P, Cordeiro JL, et al. Winter is coming: the future of cryopreservation. BMC Biol. 2021;19(1):56. https://doi.org/10.1186/s12915-021-00976-8Awan M, Buriak I, Fleck R, Fuller B, Goltsev A, Kerby J, et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity? Regenerative medicine. 2020;15(3):1463-91. https://doi.org/10.2217/rme-2019-0145Awan M, Buriak I, Fleck R, Fuller B, Goltsev A, Kerby J, et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity? Regenerative medicine. 2020;15(3):1463-91. https://doi.org/10.2217/rme-2019-0145Liu X, Pan Y, Liu F, He Y, Zhu Q, Liu Z, et al. A review of the material characteristics, antifreeze mechanisms, and applications of cryoprotectants (CPAs). Journal of Nanomaterials. 2021;2:1-14. https://doi.org/10.1155/2021/9990709Liu X, Pan Y, Liu F, He Y, Zhu Q, Liu Z, et al. A review of the material characteristics, antifreeze mechanisms, and applications of cryoprotectants (CPAs). Journal of Nanomaterials. 2021;2:1-14. https://doi.org/10.1155/2021/9990709Заикина ЕВ, Гончарова АС, Позднякова ВВ, Пандова ОВ, Пржедецкий ЮВ, Воловик ВГ и др. Обзор современных методов криоконсервации различных видов биологического материала. Современные проблемы науки и образования. 2022;4:135.Zaikina EV, Goncharova AS, Pozdnyakova VV, Pandova OV, Przhedetskiy YV, Volovik VG, et al. Review of modern methods of cryopreservation of various types of biological material. Мodern problems of science and education. 2022;4:135 (In Russ.). https://doi.org/10.17513/spno.31790Тимохина ОВ, Гончаров АЕ. Характеристика криопротекторов, используемых для долговременного хранения донорских дендритных клеток. Экспериментальная биология и биотехнология. 2021;3:102–8.Timohina OV, Hancharou AY. Characteristics of cryoprotectors used for long-term storage of donor dendritic cells. Experimental Biology and Biotechnology. 2021;3:102-8 (In Russ.). https://doi.org/10.33581/2521-1722-2021-3-102-108Силюкова ЮЛ, Станишевская ОИ, Плешанов НВ, Курочкин АА. Эффективность использования комбинаций сахаридов в средах для криоконсервации спермы петухов. Сельскохозяйственная биология. 2020;55(6):1148-58.Silyukova YI, Stanishevskaya OI, Pleshanov NV, Kurochkin AA. Efficiency of using a combination of mono- and disaccharides in a diluent for freezing rooster semen. Sel’skokhozyaistvennaya biologiya. 2020;55(6):1148-58 (In Russ.). https://doi.org/10.15389/agrobiology.2020.6.1148rusJahan S, Kaushal R, Pasha R, Pineault N. Current and Future Perspectives for the Cryopreservation of Cord Blood Stem Cells. Transfus Med Rev. 2021;35(2):95-102. https://doi.org/10.1016/j.tmrv.2021.01.003Jahan S, Kaushal R, Pasha R, Pineault N. Current and Future Perspectives for the Cryopreservation of Cord Blood Stem Cells. Transfus Med Rev. 2021;35(2):95-102. https://doi.org/10.1016/j.tmrv.2021.01.003Tas RP, Sampaio-Pinto V, Wennekes T, van Laake LW, Voets IK. From the freezer to the clinic: Antifreeze proteins in the preservation of cells, tissues, and organs. EMBO Rep. 2021;22(3):52162. https://doi.org/10.15252/embr.202052162Tas RP, Sampaio-Pinto V, Wennekes T, van Laake LW, Voets IK. From the freezer to the clinic: Antifreeze proteins in the preservation of cells, tissues, and organs. EMBO Rep. 2021;22(3):52162. https://doi.org/10.15252/embr.202052162Whaley D, Damyar K, Witek RP, Mendoza A, Alexander M, Lakey JR. Cryopreservation: An Overview of Principles and Cell-Specific Considerations. Cell Transplant. 2021;30:963689721999617. https://doi.org/10.1177/0963689721999617Whaley D, Damyar K, Witek RP, Mendoza A, Alexander M, Lakey JR. Cryopreservation: An Overview of Principles and Cell-Specific Considerations. Cell Transplant. 2021;30:963689721999617. https://doi.org/10.1177/0963689721999617Ma J, Zhang X, Cui Z, Zhao M, Zhang L, Qi H. Investigation into antifreeze performances of natural amino acids for novel CPA development. J Mater Chem B. 2023;11(18):4042-9. https://doi.org/10.1039/d3tb00131hMa J, Zhang X, Cui Z, Zhao M, Zhang L, Qi H. Investigation into antifreeze performances of natural amino acids for novel CPA development. J Mater Chem B. 2023;11(18):4042-9. https://doi.org/10.1039/d3tb00131hZhong Y, McGrath JK, Gong B. Dipropinonates of Sugar Alcohols as Water-Soluble, Nontoxic CPAs for DMSO-Free Cell Cryopreservation. ACS Biomater Sci Eng. 2021;7(10):4757-62. https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.1c00995Zhong Y, McGrath JK, Gong B. Dipropinonates of Sugar Alcohols as Water-Soluble, Nontoxic CPAs for DMSO-Free Cell Cryopreservation. ACS Biomater Sci Eng. 2021;7(10):4757-62. https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.1c00995Кит ОИ, Гненная НВ, Филиппова СЮ, Чембарова ТВ, Лысенко ИБ, Новикова ИА и др. Криоконсервация гемопоэтических стволовых клеток периферической крови в трансплантологии: современное состояние и перспективы. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2023;22(11):3691.Kit OI, Gnennaya NV, Filippova SYu, Chembarova TV, Lysenko IB, Novikova IA, et al. Cryostorage of peripheral blood hematopoietic stem cells in transplantology: current status and prospects. Cardiovascular Therapy and Prevention. 2023;22(11):3691 (In Russ.). https://doi.org/10.15829/1728-8800-2023-3691Dou M, Lu C, Sun Z, Rao W. Natural cryoprotectants combinations of l-proline and trehalose for red blood cells cryopreservation. Cryobiology. 2019;91:23-9. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2019.11.002Dou M, Lu C, Sun Z, Rao W. Natural cryoprotectants combinations of l-proline and trehalose for red blood cells cryopreservation. Cryobiology. 2019;91:23-9. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2019.11.002Craveiro R, Castro V, Viciosa M, Dionísio M, Reis R, Duarte A, et al. Influence of natural deep eutectic systems in water thermal behavior and their applications in cryopreservation. Journal of Molecular Liquids. 2021;329:115533. https://doi.org/10.1016/j.molliq.2021.115533Craveiro R, Castro V, Viciosa M, Dionísio M, Reis R, Duarte A, et al. Influence of natural deep eutectic systems in water thermal behavior and their applications in cryopreservation. Journal of Molecular Liquids. 2021;329:115533. https://doi.org/10.1016/j.molliq.2021.115533Бордин ДС, Индейкина ЛХ, Винницкая ЕВ, Данилов МА, Сабельникова ЕА. Лактулоза: преимущества и место препарата в клинических рекомендациях. Эффективная фармакотерапия. 2023;19(35):42–9.Bordin DS, Indeikina LKh, Vinnitskaya EV, Danilov MA, Sabelnikova EA, Lactulose: The Advantages and Place of the Drug in Clinical Recommendations. Effective pharmacotherapy. 2023;19(35):42–9 (In Russ.). https://doi.org/10.33978/2307-3586-2023-19-35-42-49Ait-Aissa A, Aider M. Lactulose: production and use in functional food, medical and pharmaceutical applications. Practical and critical review. Int. J. Food Sci. Technol. 2014;49(5):1245–53. https://doi.org/10.1111/ijfs.12465Ait-Aissa A, Aider M. Lactulose: production and use in functional food, medical and pharmaceutical applications. Practical and critical review. Int. J. Food Sci. Technol. 2014;49(5):1245–53. https://doi.org/10.1111/ijfs.12465Рябцева СА, Храмцов АГ, Будкевич РО, Анисимов ГС, Чукло АО, Шпак МА. Физиологические эффекты, механизмы действия и применение лактулозы. Вопросы питания. 2020;89(2):5-20.Ryabtsevа SA, Khramtsov AG, Budkevich RO, Anisimov GS, Chuklo AO, Shpak MA. Physiological effects, mechanisms of action and application of lactulose. Voprosy pitaniia. 2020;89(2):5– 20 (In Russ.). https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10012Killer J, Bunešová VN, Modráčková N, Vlková E, Pechar R, Šplíchal I. Lactulose in combination with soybean lecithin has a cryoprotective effect on probiotic taxa of bifidobacteria and Lactobacillaceae. Lett Appl Microbiol. 2023;76(2):ovad008. https://doi.org/10.1093/lambio/ovad008Killer J, Bunešová VN, Modráčková N, Vlková E, Pechar R, Šplíchal I. Lactulose in combination with soybean lecithin has a cryoprotective effect on probiotic taxa of bifidobacteria and Lactobacillaceae. Lett Appl Microbiol. 2023;76(2):ovad008. https://doi.org/10.1093/lambio/ovad008Сидоркевич СВ, Гришина ГВ, Ремизова МИ, Красильщикова ИВ, Юдина ВА, Колесов АА. Влияние отрицательных температур, криопротекторов и криоконсервантов на структурно-функциональное состояние клеток крови. Трансфузиология. 2022;4:374-88.20Sidorkevich SV, Grishina GV, Remizova MI, Krasilshchikova IV, Yudina VA, Kolesov AA. Influence of negative temperatures, cryoprotectors and cryopreservatives on the structural and functional state of blood cells. Transfusiology. 2022;4:374-88 (In Russ.). EDN: IKXPOPDayal R, Beyls E, Vral A, Baeyens A. The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood. J Vis Exp. 2024;204. https://doi.org/10.3791/65855Dayal R, Beyls E, Vral A, Baeyens A. The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood. J Vis Exp. 2024;204. https://doi.org/10.3791/65855Blackwell AD, Garcia AR, Keivanfar RL, Bay S. A field method for cryopreservation of whole blood from a finger prick for later analysis with flow cytometry. Am J Phys Anthropol. 2021;174(4):670-85. https://doi.org/10.1002/ajpa.24251Blackwell AD, Garcia AR, Keivanfar RL, Bay S. A field method for cryopreservation of whole blood from a finger prick for later analysis with flow cytometry. Am J Phys Anthropol. 2021;174(4):670-85. https://doi.org/10.1002/ajpa.24251Давыдкин ИЛ, Федорова ОИ, Захарова НО, Селезнев АВ. Компьютерная морфометрия лимфоцитов периферической крови у больных пневмонией различного возраста. Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2010;12(7):1737-41.Davydkin IL, Fyodorova OI, Zaharova NO, Seleznyov AV. Computer morphometry of peripheric blood lymphocytes at patients of different age with pneumonia. Proceedings of the Samara Scientific Center of the Russian Academy of Sciences. 2010;12(7):1737-41 (In Russ.).Кирьянова ГЮ, Волкова СД, Касьянов АД, Гришина ГВ, Голованова ИС, Чечеткин АВ. Криоконсервирование эритроцитов при температурах –40°С и –80°С. Вестник Международной академии холода. 2017;1:72-8.Kiryanova GYu, Volkova SD, Kasyanov AD, Grishina GV, Golovanova IS, Chechetkin AV. Cryopreservation of erythrocytes at –40°С and –80°С. Bulletin of the International Academy of Cold. 2017;1:72-8 (In Russ.). https://doi.org/10.21047/1606-4313-2017-16-1-72-78Исаева НВ, Минаева НВ, Утемов СВ, Шерстнев ФС, Зорина НА, Змеева ЮС и др. Жизнеспособность ядросодержащих клеток в лейкоконцентратах на этапах их получения, замораживания и декриоконсервирования. Бюллетень сибирской медицины. 2023;22(2):46–52.Isaeva NV, Minaeva NV, Utemov SV, Sherstnev PhS, Zorina NA, Zmeeva YuS, et al. Viability of mononuclear cells in leukocyte concentrates at the stages of their preparation, freezing, and thawing. Bulletin of Siberian Medicine. 2023;22(2):46–52 (In Russ.). https://doi.org/10.20538/1682-0363-2023-2-46-52Ветошкин КА, Утемов СВ, Шерстнев ФС, Князев МГ, Костяев АА. Результаты криоконсервирования донорских тромбоцитных концентратов при низких и ультранизких температурах. Трансфузиология. 2015;2(16):22-7.Vetoshkin KA, Utemov SV, Sherstnev PhS, Knyazev MG, Kostyaev AA. Results of donors’ blood platelets concentrates cryopreservation at low and ultra-low temperatures. Transfusiology. 2015;2(16):22-7 (In Russ.). EDN: VVHTIXВласов АА, Андрусенко СФ, Денисова ЕВ, Эльканова АБ, Каданова АА, Мельченко ЕА и др. Морфофункциональное состояние криоконсервированных форменных элементов крови при умеренно низких температурах. Вестник РГМУ. 2024;(5).Vlasov AA, Andrusenko SF, Denisova EV, Elkanova AB, Kadanova AA, Melchenko EA, et al. Morphofunctional state of cryopreserved blood cells at moderate low temperature. Bulletin of RSMU. 2024;(5) (In Russ.). https://doi.org/10.24075/vrgmu.2024.038Широких ИГ, Полежаева ТВ, Широких АА, Худяков АН, Сергушкина МИ, Назарова ЯИ и др. Криозащитные свойства полисахаридсодержащей фракции Hericium erinaceus БП 16. Известия РАН. Серия биологическая. 2020;1:5–11Shirokikh IG, Polezhaeva TV, Shirokikh AA, Khudyakov AN, Sergushkina MI, Nazarova JI, et al. Cryoprotective Properties of the Polysaccharide Fraction of the Mushroom Hericium erinaceus BP 16. Bulletin of the Russian Academy of Sciences. Biological Series. 2020;(1):5–11 (In Russ.). https://doi.org/10.31857/s0002332920010129Murray A, Kilbride P, Gibson M. Trehalose in cryopreservation. Applications, mechanisms and intracellular delivery opportunities. RSC Med. Chem. 2024;15:2980–95. https://doi.org/10.1039/D4MD00174EMurray A, Kilbride P, Gibson M. Trehalose in cryopreservation. Applications, mechanisms and intracellular delivery opportunities. RSC Med. Chem. 2024;15:2980–95. https://doi.org/10.1039/D4MD00174EАндрусенко СФ, Власов АА, Рыбчинская ЭЕ, Сорокина УЕ. Криопротектор для цельной крови. Патент Российской Федерации № 2816446; 2024.Andrusenko SF, Vlasov AA, Rybchinskaya EE, Sorokina UE. Cryoprotector for whole blood. Patent of the Russian Federation № 2816446; 2024 (In Russ.).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.