mesЭкстремальная биомедицинаExtreme Medicine3033-89643033-8972Centre for Strategic Planning of the Federal Medical and Biological Agency10.47183/mes.2024-244mes-244Research ArticleОНКОЛОГИЯОNCOLOGYРазработка и оценка набора реагентов для количественного определения уровня экспрессии мРНК химерного гена BCR::ABL1Development and evaluation of a reagent set for quantitation of mRNA expression level of chimeric BCR::ABL1 genehttps://orcid.org/0000-0002-8605-7432АвдонинаМ. А.AvdoninaM. A.

Авдонина Мария Алексеевна - канд. биол. наук

Москва

Mariia A. Avdonina

Moscow

MAvdonina@cspmz.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8255-6226КуклинаН. Г.KuklinaN. G.

Куклина Наталья Григорьевна - канд. биол. наук

Москва

Natalia G. Kuklina

Moscow

NKuklina@cspfmba.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6223-8258ГлавацкаяА. А.GlavatskayaA. A.

Главацкая Арина Андреевна

Москва

Arina A. Glavatskaya

Moscow

fabessonova1705@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0004-6282-0036ДмитриевВ. К.DmitrievV. K.

Дмитриев Владислав Константинович

Москва

Vladislav K. Dmitriev

Moscow

meetyourmeetr1ch@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-7753-3698ЧегодарьА. С.ChegodarA. S.

Чегодарь Анжелика Сергеевна

Москва

Anzhelika S. Chegodar

Moscow

a.chegodar@mknc.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3573-8342ДанишевичА. М.DanishevichA. M.

Данишевич Анастасия Михайловна

Москва

Anastasia M. Danishevich

Moscow

a.danishevich@mknc.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3119-7673БодуноваН. А.BodunovaN. A.

Бодунова Наталья Александровна - канд. мед. наук

Москва

Natalia A. Bodunova

Moscow

n.bodunova@mknc.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6954-1564АбрамовИ. С.AbramovI. S.

Абрамов Иван Сергеевич

Москва

Ivan S. Abramov

Moscow

i.abramov@mknc.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9734-0620ШипулинГ. А.ShipulinG. A.

Шипулин Герман Александрович - канд. мед. наук

Москва

German A. Shipulin

Moscow

shipulin@cspfmba.ruЦентр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентстваРоссияCentre for Strategic Planning, of the Federal Medical and Biological AgencyRussian FederationЦентр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства; Научно-исследовательский институт медицины труда им. академика Н.Ф. ИзмероваРоссияCentre for Strategic Planning, of the Federal Medical and Biological Agency; Izmerov Research Institute of Occupational HealthRussian FederationМосковский клинический научный центр имени А.С. ЛогиноваРоссияLoginov Moscow Clinical Scientific CentreRussian Federation2025230320252717479Copyright © Авдонина М.А., Куклина Н.Г., Главацкая А.А., Дмитриев В.К., Чегодарь А.С., Данишевич А.М., Бодунова Н.А., Абрамов И.С., Шипулин Г.А., 20252025Авдонина М.А., Куклина Н.Г., Главацкая А.А., Дмитриев В.К., Чегодарь А.С., Данишевич А.М., Бодунова Н.А., Абрамов И.С., Шипулин Г.А.Avdonina M.A., Kuklina N.G., Glavatskaya A.A., Dmitriev V.K., Chegodar A.S., Danishevich A.M., Bodunova N.A., Abramov I.S., Shipulin G.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.extrememedicine.ru/jour/article/view/244Введение

Введение. Хронический миелолейкоз (ХМЛ) — миелопролиферативное заболевание, ассоциированное с транслокацией t(9;22)(q34;q11), в результате которой образуется химерный ген BCR::ABL1. Одним из методов постановки диагноза, а также определения минимальной остаточной болезни является молекулярно-генетическое исследование, а именно количественное определение уровня экспрессии мРНК химерного гена BCR::ABL1.

Цель

Цель. Апробация разработанной мультиплексной тест-системы для одновременного количественного определения транскриптов e13a2 (b2a2) и e14a2 (b3a2) транслокации p210 в сравнении с зарегистрированным в России аналогом.

Материалы и методы

Материалы и методы. В качестве образцов использовали 50 проб периферической крови. Из них 39 проб принадлежали пациентам с установленным диагнозом ХМЛ, 11 образцов от здоровых участников использовались для подтверждения аналитической специфичности. В состав набора реагентов входят разработанные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды, концентрация которых была подобрана экспериментально, а также оригинальные реагенты производства ФГБУ «ЦСП» ФМБА (Россия). Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v.4.5.0 (разработчик — ООО «Статтех», Россия). Различия считались значимыми при p < 0,05.

Результаты

Результаты. Экспериментальные данные по определению аналитических и диагностических характеристик разработанного набора показали следующие результаты: относительная чувствительность, определяемая с помощью клеточных стандартов, составила 0,01%. Воспроизводимая аналитическая чувствительность составила 100 копий/мл (CV = 1,86%). При проверке аналитической специфичности было показано отсутствие ложноспецифических выходов. При тестировании реагентов тест-системы на клинических образцах было выявлено полное совпадение (100%) с результатами, полученными при использовании аналога зарегистрированного в России набора.

Выводы

Выводы. Апробация разработанного нами набора реагентов продемонстрировала достаточно высокие показатели аналитической и диагностической чувствительности, что позволит обнаруживать и выявлять количество мРНК химерного гена BCR::ABL1 как для диагностики, назначения своевременной и точной терапии, так и для мониторинга минимальной остаточной болезни.

Introduction

Introduction. Chronic myeloid leukemia is a myeloproliferative disease associated with a t(9;22)(q34;q11) translocation resulting in a chimeric BCR::ABL1 gene. Molecular genetic studies are used as a diagnostic method and for determination of minimal residual disease by quantification of the mRNA expression level of the chimeric BCR::ABL1 gene.

Objective

Objective. To validate the developed multiplex test system for simultaneous quantitative determination of e13a2 (b2a2) and e14a2 (b3a2) transcripts of translocation p210 in comparison with the analog system registered in Russia.

Materials and methods

Materials and methods. In total, 50 peripheral blood samples were used. Of these, 39 belonged to patients diagnosed with CML; 11 blood samples from healthy people were used to confirm analytical specificity. The reagent kit includes the specifically developed primers and fluorescently labeled probes, the concentration of which was selected experimentally, as well as original reagents manufactured by the Centre for Strategic Planning, Federal Medical and Biological Agency (Russia). Statistical analysis was performed using the StatTech v.4.5.0 software (developed by StatTech, Russia). Differences were considered significant at p < 0.05.

Results

Results. The conducted analytical and diagnostic characterization of the developed kit showed the following results. The relative sensitivity determined using cell standards was 0.01 %. The reproducible analytical sensitivity was 100 copies/mL (CV = 1.86 %). In analytical specificity testing, the absence of false results was shown. When testing the reagents of the test system on clinical samples, the complete convergence (100 %) with the results obtained using the reference kit was revealed.

Conclusions

Conclusions. Approbation of the developed reagent set showed its sufficiently high analytical sensitivity and diagnostic sensitivity. This set can be used for identification and quantitative determination of the mRNA of the chimeric BCR::ABL1 gene for the purposes of diagnosis, timely and accurate therapy, and monitoring of minimal residual disease.

хронический миелолейкозхимерный ген BCR::ABL1молекулярно-генетический мониторингchronic myeloid leukemiachimeric BCR::ABL1 genemolecular genetic monitoringработа выполнена без спонсорской поддержкиthe work was carried out without sponsorshipReferencesRavandi F, Kebriaei P. Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Hematol Oncol Clin North Am. 2009;23(5):1043–63. https://doi.org/10.1016/j.hoc.2009.07.007Ravandi F, Kebriaei P. Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Hematol Oncol Clin North Am. 2009;23(5):1043–63. https://doi.org/10.1016/j.hoc.2009.07.007Каприн АД, ред. Злокачественные новообразования в России в 2022 году (заболеваемость и смертность) М.:МНИОИ им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2023.Kaprin AD, red. Malignant neoplasms in Russia in 2022 (morbidity and mortality). M.: P.A. Herzen Moscow State Medical Research Institute — branch of the Federal State Budgetary Institution NMIC Radiology of the Ministry of Health of Russia; 2023(In Russ.).Etienne G, Guilhot J, Rea D, Rigal-Huguet F, Nicolini F, Aude C, et al. Long-Term Follow-Up of the French Stop Imatinib (STIM1) Study in Patients With Chronic Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 2017;35(3):298–305. https://doi.org/10.1200/JCO.2016.68.2914Etienne G, Guilhot J, Rea D, Rigal-Huguet F, Nicolini F, Aude C, et al. Long-Term Follow-Up of the French Stop Imatinib (STIM1) Study in Patients With Chronic Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 2017;35(3):298–305. https://doi.org/10.1200/JCO.2016.68.2914Hochhaus A., Baccarani M, Silver RT, Schiffer C, Apperley JF, Cervantes F., et al. European LeukemiaNet 2020 Recommendations for Treating Chronic Myeloid Leukemia. Leukemia. 2020;34(4):966–84. https://doi.org/10.1038/s41375-020-0776-2Hochhaus A., Baccarani M, Silver RT, Schiffer C, Apperley JF, Cervantes F., et al. European LeukemiaNet 2020 Recommendations for Treating Chronic Myeloid Leukemia. Leukemia. 2020;34(4):966–84. https://doi.org/10.1038/s41375-020-0776-2Kantarjian H., Schiffer С., Jones D., Cortes J. Monitoring the response and course of chronic myeloid leukemia in the modern era of BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors: practical advice on the use and interpretation of monitoring methods. Blood. 2008;111(4): 1774–80. https://doi.org/10.1182/blood-2007-09-110189Kantarjian H., Schiffer С., Jones D., Cortes J. Monitoring the response and course of chronic myeloid leukemia in the modern era of BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors: practical advice on the use and interpretation of monitoring methods. Blood. 2008;111(4): 1774–80. https://doi.org/10.1182/blood-2007-09-110189Kitamura H, Tabe Y, Ai T, Tsuchiya K, Yuri M, Misawa S, et al. A new highly sensitive real-time quantitative-PCR method for detection of BCR-ABL1 to monitor minimal residual disease in chronic myeloid leukemia after discontinuation of imatinib. PLoS One. 2019;14(3):e0207170. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0207170Kitamura H, Tabe Y, Ai T, Tsuchiya K, Yuri M, Misawa S, et al. A new highly sensitive real-time quantitative-PCR method for detection of BCR-ABL1 to monitor minimal residual disease in chronic myeloid leukemia after discontinuation of imatinib. PLoS One. 2019;14(3):e0207170. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0207170Martinez RJ, Kang Q, Nennig D, Bailey N, Brown N, Betz B, et al. One-Step Multiplexed Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Quantification of p190 BCR-ABL1 Fusion Transcript in B-Lymphoblastic Leukemia. Arch Pathol Lab Med. 2022;146(1):92–100. https://doi:10.3390/diagnostics12061305Martinez RJ, Kang Q, Nennig D, Bailey N, Brown N, Betz B, et al. One-Step Multiplexed Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Quantification of p190 BCR-ABL1 Fusion Transcript in B-Lymphoblastic Leukemia. Arch Pathol Lab Med. 2022;146(1):92–100. https://doi:10.3390/diagnostics12061305White H.E, Matejtschuk P, Rigsby P, Gabert J, Lin F, Wang YL, et al. Establishment of the first World Health Organization International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR-ABL mRNA. Blood. 2010;116(22):e111–7. https://doi.org/10.1182/blood-2010-06-291641White H.E, Matejtschuk P, Rigsby P, Gabert J, Lin F, Wang YL, et al. Establishment of the first World Health Organization International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR-ABL mRNA. Blood. 2010;116(22):e111–7. https://doi.org/10.1182/blood-2010-06-291641Özdemir NZ, Kılıçaslan NA, Yılmaz M, Eşkazan AE. Guidelines for the Treatment of Chronic Myeloid Leukemia From the NCCN and ELN: Differences and Similarities. Int J Hematol. 2023;117(1):3–15. https://doi.org/10.1007/s12185-022-03446-1Özdemir NZ, Kılıçaslan NA, Yılmaz M, Eşkazan AE. Guidelines for the Treatment of Chronic Myeloid Leukemia From the NCCN and ELN: Differences and Similarities. Int J Hematol. 2023;117(1):3–15. https://doi.org/10.1007/s12185-022-03446-1Kottwitz D, Hadi EH, Amrani E, Cabezas S, Dehbi H, Nadifi S, et al. Evaluation of a novel multiplex RT-qPCR assay for the quantification of leukemia-associated BCR-ABL1 translocation. Int J Hematol. 2015;102(3):335–41. https://doi.org/10.1007/s12185-015-1839-4Kottwitz D, Hadi EH, Amrani E, Cabezas S, Dehbi H, Nadifi S, et al. Evaluation of a novel multiplex RT-qPCR assay for the quantification of leukemia-associated BCR-ABL1 translocation. Int J Hematol. 2015;102(3):335–41. https://doi.org/10.1007/s12185-015-1839-4Franke GN, Maier J, Wildenberger K, Cross M, Giles FJ, Müller M.C, et al. Comparison of Real-Time Quantitative PCR and Digital Droplet PCR for BCR-ABL1 Monitoring in Patients with Chronic Myeloid Leukemia Comparative Study. J Mol Diagn. 2020;22(1):81–9. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2019.08.007Franke GN, Maier J, Wildenberger K, Cross M, Giles FJ, Müller M.C, et al. Comparison of Real-Time Quantitative PCR and Digital Droplet PCR for BCR-ABL1 Monitoring in Patients with Chronic Myeloid Leukemia Comparative Study. J Mol Diagn. 2020;22(1):81–9. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2019.08.007International Standard, 1st WHO International Genetic Reference Panel for the quantitation of BCR-ABL1 translocation NIBSC code: 09/138International Standard, 1st WHO International Genetic Reference Panel for the quantitation of BCR-ABL1 translocation NIBSC code: 09/138Winn AN, Atallah E, Cortes J, Deininger MWN, Kota V, Larson RA, et al. Estimated Savings After Stopping Tyrosine Kinase Inhibitor Treatment Among Patients With Chronic Myeloid Leukemia. JAMA Netw Open. 2023;6(12):e2347950. https://doi.org/10.1001/jamanetworkopen.2023.47950Winn AN, Atallah E, Cortes J, Deininger MWN, Kota V, Larson RA, et al. Estimated Savings After Stopping Tyrosine Kinase Inhibitor Treatment Among Patients With Chronic Myeloid Leukemia. JAMA Netw Open. 2023;6(12):e2347950. https://doi.org/10.1001/jamanetworkopen.2023.47950Cantoni N, Sommavilla R, Seitz P, Kulenkampff E, Kahn S, Lambert JF, et al. A multicenter real-world evidence study in the Swiss treatment landscape of chronic myeloid leukemia. BMC Cancer. 2022;22(1):1192. https://doi.org/10.1186/s12885-022-10241-yCantoni N, Sommavilla R, Seitz P, Kulenkampff E, Kahn S, Lambert JF, et al. A multicenter real-world evidence study in the Swiss treatment landscape of chronic myeloid leukemia. BMC Cancer. 2022;22(1):1192. https://doi.org/10.1186/s12885-022-10241-yCross NCP, Ernst T, Branford S, Cayuela J-M ,Deininger M, Fabarius A,et al. European LeukemiaNet laboratory recommendations for the diagnosis and management of chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2023;37(11):2150–67. https://doi.org/10.1038/s41375-023-02048-yCross NCP, Ernst T, Branford S, Cayuela J-M ,Deininger M, Fabarius A,et al. European LeukemiaNet laboratory recommendations for the diagnosis and management of chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2023;37(11):2150–67. https://doi.org/10.1038/s41375-023-02048-yРябчикова НР, Минниахметов ИР, Сафуанова ГШ, Исламгулов ДВ, Карунас АС, Хуснутдинова ЭК. Хронический миелолейкоз: молекулярный мониторинг в клинической практике. Онкогематология. 2013;8(1):7–16. https://doi.org/10.17650/1818-8346-2013-8-1-7-16Ryabchikova NR, Minniakhmetov IR, Safuanova GSh, Islamgulov DV, Karunas AS, Khusnutdinova EE. Chronic myelogenous leukemia: molecular monitoring in clinical practice. Oncohematology. 2013;8(1):7–16 (In Russ.). https://doi.org/10.17650/1818-8346-2013-8-1-7-16Горбенко АС, Столяр МА, Васильев ЕВ, Михалёв МА, Бахтина ВИ, Ольховик ТИ, и др. Использование набора «BCR/ABL — мультитест» в алгоритме лабораторной диагностики онкогематологических заболеваний: экономические аспекты. Клиническая лабораторная диагностика. 2021;66(9):571–6. https://doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-9-571-576Gorbenko AS, Stolyar MA, Vasiliev EV, Mikhalev MA, Bakhtina VI, Olkhovik TI, et al. Use of the «BCR/ABL — multitest» kit in the algorithm of laboratory diagnostics of oncohematological diseases: economic aspects. Klinicheskaia Laboratornaia Diagnostika.2021;66(9):571–6. https://doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-9-571-576Дубина МВ, Куевда ДА, Хомякова ТЕ, Цаур ГА, Куцев СИ, Зарицкий АЮ. Молекулярный мониторинг эффективности терапии больных хроническим миелолейкозом в России. Современная онкология. 2010;4(12):9–17. EDN: NCXVBJDubina MV, Kuevda DA, Khomyakova TE, Tsaur GA, Kutsev SI, Zaritskiy AY. Molecular monitoring of the effectiveness of therapy in patients with chronic myeloid leukemia in Russia. Journal of Modern Oncology. 2010; 4(12):9–17 (In Russ.). EDN: NCXVBJ

The authors declare that there are no conflicts of interest present.