Тузова Ирина Игоревна
Москва
Irina I. Tuzova
Moscow
Чиркина Татьяна Игоревна
Москва
Tatyana I. Chirkina
Moscow
Чуркин Игорь Алексеевич, канд. биол. наук
Москва
Igor A. Churkin, Cand. Sci. (Biol.)
Moscow
Лях Анастасия Николаевна
Москва
Anastasia N. Lyakh
Moscow
Мефёд Кирилл Михайлович, канд. биол. наук
Москва
Kirill M. Mefed, Cand. Sci. (Biol.)
Moscow
Максимов Владимир Алексеевич, д-р мед. наук
Москва
Vladimir A. Maximov, Dr. Sci. (Med.)
Moscow
Введение. Наработка в лабораториях вирусного материала в малых количествах, как правило, проводится с использованием адгерентных линий и культуральных флаконов различной площади. Необходимость увеличения выхода продукта приводит или к увеличению количества флаконов, или смене системы накопления, например на роллерные бутыли. Одним из факторов, оказывающих влияние на эффективность адгезии клеток и формирование однородного монослоя, является частота вращения роллерной бутыли. При этом отмечено небольшое количество исследований, касающихся оценки влияния частоты вращения и определения ее оптимального показателя, особенно на основе морфологии клеток.
Цель. Оптимизировать начальный этап роллерного культивирования клеточных линий Vero и HEK293 с учетом влияния частоты вращения роллерной бутыли на прикрепление клеток при посеве и формирование монослоя.
Материалы и методы. Для проведения экспериментальной работы были использованы 2 монослойные клеточные линии: Vero и HEK293. Посевные концентрации были взяты из паспортов клеточных линий и составляли 4×10⁴ кл/см². Клеточную линию засевали на роллерные бутыли и культивировали согласно диапазону частот вращения 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 и 0,6 об/мин с использованием роллерной установки Celrol Mid, Wiggens в СО2-инкубаторе D180, RWD. Через 1, 2 и 3 сут культивирования оценивали качество прикрепления клеток к ростовой поверхности и формирование монослоя путем просмотра под микроскопом ТС5400, Meiji Techno. Результаты. При культивировании клеточной линии Vero частота вращения до 0,6 об/мин не оказывала значительного влияния на адгезию клеток к поверхности. Наиболее равномерное расположение клеток наблюдали при частоте вращения 0,4–0,5 об/мин. Культура клеток НЕК293 более чувствительна к механическим воздействиям питательной среды, и при частоте вращения свыше 0,2 об/мин наблюдали атипично округлые формы клеток и нарушение полноценного их прикрепления к ростовой поверхности. При этом дальнейшее культивирование на данной частоте вращения не приводило к формированию однородного монослоя из-за медленного чередования «фазы дыхания» и «фазы питания». Следовательно, после прикрепления клеток к поверхности необходимо увеличение частоты вращения роллерной бутыли.
Выводы. Для клеточной линии Vero оптимальной частотой вращения является 0,4–0,5 об/мин, для клеточной линии HEK293 в первые сутки необходимо устанавливать 0,2 об/мин, а через сутки увеличить до 0,5 об/мин. Апробированные условия культивирования позволяют выращивать данные клеточные линии для наработки вирусной биомассы.
Introduction. Laboratory production of viral material in small quantities is performed, as a rule, using adherent cell lines and culture flasks of varying surface area. The need to increase product yield leads to either an increase in the number of flasks or a switch to other accumulation systems, such as roller bottles. One factor influencing the efficiency of cell adhesion and homogeneous monolayer formation is the rotation frequency of the roller bottle. There is a lack of available research data on the impact of rotation frequency on these parameters and determination of its optimal value, particularly based on cellular morphology.
Objective. To optimize the initial stage of roller cultivation for Vero and HEK293 cell lines, taking into account the effect of roller bottle rotation frequency on cell adhesion during seeding and monolayer formation.
Materials and methods. Experiments were conducted using two monolayer cell lines, Vero and HEK293. Seeding concentrations were taken from the cell line passports, amounting to 4×10⁴ cells/cm². Each cell line was seeded onto roller bottles and cultured according to the range of rotation frequencies (0.2, 0.3, 0.4, 0.5, and 0.6 rpm) using a Celrol Mid roller (Wiggens) in a RWD D180 CO2 incubator. Following 1, 2, and 3 days of cultivation, the quality of cell adherence to the growth surface and monolayer formation was assessed by a TC5400 microscope (Meiji Techno).
Results. During cultivation of the Vero cell line, the rotation frequency up to 0.6 rpm did not significantly affect cell adhesion to the surface. The most homogenous cell distribution was observed at rotation frequencies of 0.4–0.5 rpm. The HEK293 cell culture is more sensitive to mechanical disturbances of the nutrient medium; as a result, at rotation frequencies above 0.2 rpm, abnormally rounded cell shapes and impaired adherence to the growth surface were observed. Furthermore, continued cultivation at this rotation frequency did not lead to the formation of a homogenous monolayer due to slow alternation between the respiration and nutrition phases. Consequently, after cell adherence to the surface, the rotation frequency of the roller bottle should be increased.
Conclusions. For the Vero cell line, the optimal rotation frequency was established to be 0.4–0.5 rpm. For the HEK293 cell line, the rotation frequency should be at least 0.2 rpm during the first day followed by its increase to 0.5 rpm after 24 h. The tested cultivation conditions enable an efficient growth of these cell lines for the production of viral biomass
The authors declare that there are no conflicts of interest present.