ВВЕДЕНИЕНормальная микрофлора кишечника человека представлена широким спектром микроорганизмов, большинство из которых являются облигатными или факультативными анаэробами. Оппортунистические инфекции могут возникать непосредственно из-за облигатных возбудителей или косвенно из-за чрезмерного роста условно-патогенных микроорганизмов (УПМ); важную роль в этом играет и истощение популяции кишечных комменсалов (КК) [1]. Известно, что факторы космического полета, например измененный режим питания, гигиенических процедур, психоэмоциональное напряжение, постоянный микробный обмен, неизбежно возникающий в гермозамкнутом помещении космического корабля, негативно влияют на состав кишечной микробиоты, при этом отмечается активное размножение условно-патогенного компонента микрофлоры и снижение количества протективных видов микроорганизмов [2]. Это определяет необходимость разработки средств профилактики и снижения рисков развития дисбиотических состояний, а также проведения исследований для углубленного понимания взаимосвязей кишечной микробиоты и иных физиологических и биохимических показателей здоровья человека, что впоследствии позволит влиять на состав кишечной микробиоты через точечные воздействия на отдельные процессы в организме, например на метаболизм отдельных белков.
Подавляющее большинство бактерий обитает в толстом кишечнике. В проксимальных отделах тонкого кишечника в норме содержится до 10⁴ КОЕ/мл микроорганизмов, что связано с pH среды (7,2–7,6) и бактерицидным действием желчи. Комменсальная микрофлора кроме участия в процессах пищеварения обладает целым спектром важных для организма хозяина функций. Она осуществляет неспецифическую противовоспалительную защиту через продукцию бактериоцинов, органических кислот и веществ с бактериостатическими свойствами, стимулирует эукариотические клетки к синтезу муцина и веществ с антимикробной активностью. Кроме того, сообщество комменсальной микрофлоры направленно подавляет развитие воспалительных реакций в клетках эпителия кишечника. Очевидно, эти представители микрофлоры кишечника действуют синергично с местной иммунной системой [3][4].
Следовательно, кишечник человека является не только важной частью пищеварительной системы для переваривания пищи, всасывания воды и питательных веществ, он также играет существенную роль в организации иммунной защиты [5]. Эпителиальные клетки слизистой оболочки кишечника задействованы в иммунной регуляции. В собственной пластинке слизистой оболочки кишечника присутствуют Т- и В-клетки, защищающие организм от проникновения патогенов. Помимо этого, клетки слизистой оболочки кишечника продуцирует различные цитокины, такие как гамма-интерферон (IFN-γ), фактор некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкин 2 (IL-2) и интерлейкин 6 (IL-6), которые являются важными регуляторами как физиологических адаптивных реакций, так и врожденных иммунных реакций [6]. В частности, они могут участвовать в воспалительных реакциях и опосредовать дифференцировку, пролиферацию и активацию различных иммунных клеток [7]. Более того, кишечная микрофлора необходима для организации и осуществления различных иммунных реакций [8]. Так, микрофлора кишечных комменсалов активирует как врожденный, так и адаптивный иммунитет в клетках слизистой оболочки кишечника [9].
В настоящем исследовании нами предпринята попытка проанализировать возможную взаимосвязь комплекса белков в крови с количеством ряда бактерий кишечника женщин, участвующих в эксперименте с 3-суточной «сухой» иммерсией [10].
В проведенных ранее исследованиях микрофлоры кишечника у людей в эксперименте «сухой» иммерсии было выявлено существенное ухудшение состояния микрофлоры: увеличение доли УПМ, снижение количества КК [11].
По мнению некоторых исследователей, регуляторные и метаболические изменения, происходящие во время экспериментов с «сухой» иммерсией, отражаются и на белковом составе крови. Исследования, выполненные методами протеомики на основе масс-спектрометрии, выявили изменения уровней плазминогена, фибронектина, других факторов свертывания и фибринолиза, повышение содержания продуктов фибринолиза, активацию системы комплемента [12]. Очевидно, что протеомные методы позволяют определить белки, реагирующие на сложный комплекс факторов «сухой» иммерсии, и уточнить молекулярные механизмы изменений в различных физиологических системах.
Цель исследования — выявление взаимосвязи между уровнем белков в крови человека и количеством E. coli, Lactobacillus spp., Enterococcus spp. и Bifidobacterium spp. в кишечнике с применением экспериментальной модели 3-суточной «сухой» иммерсии для потенциального использования в качестве клинических рекомендаций по коррекции микрофлоры кишечника, основываясь на данных протеомного профиля крови.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВВ результате проведенного регрессионного анализа была выявлена взаимосвязь ряда белков с количеством кишечной палочки. В крови количество белка ENO1 (альфа-енолаза — гликолитический фермент, катализирующий превращение 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват) положительно коррелирует с количеством кишечной палочки. Основными функциями данного белка являются участие в гликолизе, процессах клеточного роста и аллергических реакциях. Кроме того, данный белок служит рецептором на поверхности лейкоцитов и стимулирует выработку иммуноглобулинов [17].
Необходимо сказать, что кишечная палочка играет важную роль в организме человека. Она способна вырабатывать ряд витаминов (B1, B2, B6, K и др.), жирные кислоты, участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных кислот и включена в процессы всасывания железа и кальция [3][5].
Показано, что E. coli продуцирует имеющее иммунологическое сходство с соматостатином вещество [16]. Также соматостатин продуцируется D-клетками тонкого кишечника, в то же время соматостатин-28 участвует в ингибировании инсулина, секретина, глюкагона, гастрина и других гормонов в желудочно-кишечном тракте. Основными функциями синтезированного в кишечнике соматостатина являются предотвращение секреции соляной кислоты, замедление перистальтики кишечника и изменение уровня желчных кислот [18].
В секрете толстого кишечника имеется значительное количество отторгнутых клеток эпителия, лимфоцитов и слизи, а также содержится небольшое количество ферментов. Либеркюнова железа (крипта), наряду с кишечными ворсинками, является одной из двух важнейших структурных единиц слизистой оболочки кишечника. На каждую ворсинку у человека приходится от 4 до 7 либеркюновых желез, максимальное их количество находится в 12-перстной кишке. Либеркюновы железы толстого кишечника выстланы однослойным цилиндрическим полярным эпителием, высота которого выше у устья, чем у основания. Эпителий либеркюновых желез содержит различные эндокринные клетки: I-клетки, продуцирующие холецистокинин (CCK), S-клетки — секретин (SCT), K-клетки — глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (GIP), M-клетки — мотилин (MLN), G-клетки — гастрин (GAST) [19]. Вышеперечисленные белки биохимически связаны между собой и с белком ACLY (АТФ-цитратлиаза), с уровнем которого коррелирует E. coli. Кроме того, ACLY и ряд дифференциально экспрессируемых генов участвуют в ErbB (эритобластический онкоген В) сигналинге и холецистокинин/гастрин сигналинге. ACLY является важным ферментом, связывающим углеводы с метаболизмом липидов путем выработки ацетил-КоА из цитрата для биосинтеза жирных кислот и холестерина [20]. Изменения уровней ACLY, вероятно, связаны с сигналингом гастрина.
Еще одним белком, оказывающим влияние на количество кишечной палочки, является MYH9 (немышечный миозин с тяжелой цепью IIa, член семейства моторных белков). MYH9 участвует в процессах секреции, цитокинезе и обеспечивает подвижность клеток. Количество E. coli отрицательно коррелирует с количеством данного белка в крови, что также может быть связано с сигналингом гастрина.
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что повышение уровня ENO1 и снижение MYH9 и ACLY способствуют увеличению численности кишечной палочки. Гены ENO1, MYH9 и ACLY коэкспрессируются и участвуют в сигналинге гастрина. Гастрин, в свою очередь, связан с холецистокинином, секретином, глюкозозависимым инсулинотропным полипептидом и мотилином, которые вырабатываются либеркюновыми железами толстой кишки. При этом глюкозозависимый инсулинотропный полипептин (инкретин) тормозит абсорбцию жиров, что, вероятно, вызывает увеличение их количества в непереваренной пище и, как следствие, приводит к увеличению количества E. coli, для которой жирные кислоты являются одним из источников энергии [21]. Инкретин также ингибирует липопротеинлипазу. По данным R.A. Scholl et al., со снижением данного фермента коррелирует высокое количество E. coli [22].
Положительно коррелирующий с количеством кишечной палочки белок ENO1 стимулирует выработку иммуноглобулинов, что может свидетельствовать об усилении иммунной активности локально в толстом кишечнике. Одним из объяснений выявленной взаимосвязи может служить предположение, что аутологичная комменсальная микрофлора кишечника, вероятно, обладает толерантностью к местно выделяемым иммуноглобулинам. Аналогичная взаимосвязь отмечена и для другого облигатного представителя кишечной флоры — Lactobacillus spp. Суммируя вышесказанное: ENO1, MYH9 и ACLY тесно связаны с процессами экскреции биологически активных веществ клетками либеркюновых желез толстой кишки, в частности инкретина (GIP), который, в свою очередь, учитывая его функции, способствует увеличению численности кишечной палочки.
Белок DPP3 (дипептидилпептидаза 3) является цинк-зависимой пептидазой, внутриклеточной сериновой пептидазой и обладает участком уникальной каталитической последовательности, обеспечивающей деградацию олигопептидов с остатками от 4 до 10 аминокислот. Данный участок в нашем исследовании имел достаточно сильную отрицательную корреляционную связь с количеством кишечной палочки. Известно, что белок DPP3 имеет широкий спектр биологических функций. Так, он участвует во внутриклеточном расщеплении белков, кроме того, в некоторых исследованиях [23] была показана активность DPP3 в клетках врожденной иммунной системы, например в полиморфно-ядерных гранулоцитах и нейтрофилах, что отчасти подтверждает его активное участие в регуляции иммунной функции организма. Интересно отметить, что в нашем исследовании была выявлена сильная отрицательная корреляционная связь количества данного белка как с количеством кишечной палочки, так и с количеством гемолитических стафилококков.
В проведенном исследовании также было установлено, что уровень белка SPTA1 имел достаточно сильную отрицательную корреляцию с количеством кишечной палочки, однако, учитывая функции данного белка, возможные причины взаимодействия уровней данного белка и числа представителей E. coli остаются неясными.
Бифидобактерии являются одними из важнейших компонентов кишечной микрофлоры. Они участвуют в синтезе лактата и ацетата, регулирующих pH содержимого кишечника, а также обеспечивают усиление колонизационной резистентности кишечной микрофлоры.
В нашем исследовании наиболее сильные связи с количеством бифидобактерий в кишечнике были выявлены для белков EPB41, A1BG, VCP, C8B и CCT2, также слабая корреляционная связь установлена с количеством белков FAH и YWHAE.
Белок, кодируемый геном EPB41 (мембранный белок эритроцитов band 4.1), представляет собой многофункциональный протеин, который опосредует взаимодействия между цитоскелетом эритроцитов и плазматической мембраной. Кодируемый геном EPB41 белок связывает и стабилизирует дофаминовые рецепторы D2 и D3 на плазматической мембране нейронов, участвует в регуляции транспорта ионов кальция и регуляции кишечной абсорбции [24]. В проведенных исследованиях была установлена положительная корреляция между количеством белка EPB41 и количеством бифидобактерий. Отмечено, что при снижении количества белка EPB41 наблюдается нарушение всасывания кальция в клетках тонкого кишечника [23]. Таким образом, при увеличении количества белка EPB41 происходит усиление абсорбции кальция в эпителии тонкого кишечника. Аналогичный процесс контролируется и бифидобактериями, которые также вызывают усиление всасывания ионов кальция. Наибольшее количество Bifidobacterium spp. содержится в толстом отделе кишечника, в то же время бифидобактерии и лактобациллы составляют около 20–30% микрофлоры тонкого кишечника, локализуясь в основном в тощей кишке [25].
Одной из предполагаемых функций белка A1BG (альфа-1-B гликопротеин), экспрессирующегося в печени, является участие в распознавании клеток и регуляции клеточного поведения [26]. Для данного белка отмечена положительная корреляционная связь с количеством бифидобактерий, что может быть объяснено толерантностью иммунной системы в отношении КК и усилении иммунного ответа на фоне стрессового фактора, которым является «сухая» иммерсия. Важно отметить, что белок C8B (бета-цепь С8 комплемента, лектиновый путь активации), который также играет ключевую роль в реализации механизмов врожденного и адаптивного иммунного ответа, отрицательно коррелирует с количеством бифидобактерий в кишечнике.
Белок CCT2 (бета-субъединица белка 1-го Т-комплекса, молекулярный шаперон) способствует сворачиванию протеинов при гидролизе АТФ и в составе комплекса TRiC (шаперонин) играет роль в сворачивании актина и тубулина. Согласно данным литературы, спектриновый цитоскелет является мишенью для кишечных бактериальных патогенов (например, патогенных штаммов E. coli, S. Typhimurium, L. Monocytogene) за счет усиления адгезии клеток и играет решающую роль в прогрессировании дисбиотических состояний [27]. Вероятно, аналогичный механизм также позволяет усилить адгезию Bifidobacterium spp. на эпителии кишечника и таким образом способствовать их росту, поскольку в нашем исследовании была отмечена положительная корреляционная связь количества данного белка с количеством бифидобактерий.
В то же время YWHAE (белок активации тирозин-3-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы эпсилон), участвующий в регуляции широкого спектра как общих, так и специализированных сигнальных путей, также задействован в реализации различных биохимических процессов, связанных с передачей сигналов, таких как деление клеток и регуляция чувствительности к инсулину. Его уровень тесно связан с количеством белка HSF1 (фактор теплового шока 1), продукция которого клеткой, в свою очередь, индуцируется воздействием не только температурного стресса, но и множеством других провоцирующих факторов, а именно: гипоксических условий, воздействия ксенобиотиков, протеотоксического стресса [28]. Взаимосвязь уровней белка YWHAE в крови и количества Bifidobacterium spp. в кишечной флоре отрицательная. То есть при усилении воздействия стрессовых факторов и увеличении соответственно белка YWHAE в крови происходит угнетение роста бифидобактерий, что подтверждает взаимосвязь между уровнями стресса различной этиологии и кишечной флоры.
Белок FAH (фермент фумарилацетоацетат гидролаза, который расщепляет 4-фумарилацетоацетат до ацетоацетата и фумарата, обеспечивая финальную стадию катаболизма аминокислоты тирозина), как это следует из его основной функции, вовлечен в метаболизм тирозина и является последним из пяти ферментов, расщепляющих данную аминокислоту. Следствием действия этой гидролазы и превращения 4-фумарилацетоацетата в фумарат и ацетоацетат является повышение уровня кетоновых тел в крови. Было показано, что избыток кетоновых тел, например при кетодиете, снижает количество бифидобактерий, то есть между ними, по данным Q.Y. Ang, существует отрицательная корреляционная взаимосвязь [29]. В нашем эксперименте установлена прямая положительная корреляционная связь между количеством белка FAH и количеством Bifidobacterium spp., хотя степень выраженности ее была относительно слабой.
Вместе с тем белок VCP (валозин-содержащий белок) — АТФаза переходного эндоплазматического ретикулума является компонентом процесса деградации белков, связанного с эндоплазматической сетью и отвечающего за поддержание протеостаза клеток, в том числе эндотелия кишечника. Также в отдельных исследованиях было выдвинуто предположение о возможном вкладе белка VCP в течение инфекции, вызываемой токсоплазмой [30]. Данный белок положительно коррелирует с количеством бифидобактерий. Кроме того, он коэкспрессируется с белками CCT2 и YWHAE.
Лактобациллы играют важную роль в поддержании колонизационной резистентности желудочно-кишечного тракта. Несмотря на то что большинство бактерий в ЖКТ обитают в толстом кишечнике, лактобациллы и энтерококки являются доминирующей флорой в двенадцатиперстной и тощей кишке. Их количество по сравнению с толстой кишкой невелико (около 10³–10⁴ КОЕ/мл), однако они играют важную роль в иммуномодуляции и проявляют антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов [31].
Большинство штаммов Lactobacillus spp., заселяющих кишечник человека, являются гомоферментативными и образуют в качестве результата брожения преимущественно молочную кислоту, используя гликолиз для образования лактата из глюкозы. По отношению к кислороду большинство лактобацилл являются аэротолерантными анаэробами, то есть активнее всего растут при дефиците кислорода.
В нашем исследовании при анализе данных была выявлена взаимосвязь количества белков ENO1, CA2, S100A6 и HSPA4 с количеством лактобацилл. При этом ENO1 и CA2 имели положительную, а S100A6 и HSPA4 — отрицательную корреляционную связь с количеством Lactobacillus spp.
В некоторых исследованиях установлено, что ENO1 является белком, обеспечивающим толерантность клеток к гипоксии, а также катализирует превращение 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват в процессе гликолиза, причем присутствует как в клетках и тканях человека, так и у некоторых видов Lactobacillus spp. Вероятнее всего, взаимосвязь количества данного белка с количеством лактобацилл обусловлена в первую очередь увеличением толерантности клеток кишечника к гипоксии, которая, в свою очередь, способствует росту количества лактобацилл.
Белок CA2, принадлежащий к семейству карбоангидраз, играет решающую роль в функционировании гемоглобина благодаря катализу процесса гидратации углекислого газа с образованием угольной кислоты и последующей диссоциацией ее в воде. Это приводит к снижению pH крови, что, в свою очередь, снижает сродство гемоглобина к кислороду. Таким образом, увеличение количества данного белка также связано с гипоксией и, как следствие, с созданием наиболее благоприятных условий для размножения Lactobacillus spp.
Кальций-связывающий белок A6 S100A6 (S100) играет важную роль в связывании кальция. Уровень данного белка в крови отрицательно коррелирует с количеством лактобацилл (Lactobacillus spp.), которые в процессе метаболизма цитрата используют ионы кальция [32]. Следовательно, при увеличении количества белка S100A6 количество кальция, необходимого для метаболизма лактобацилл, снижается и уровень Lactobacillus spp. падает.
Установлено, что белок HSPA4 (член семейства белков теплового шока Hsp110) имеет важные функции молекулярного шаперона внутри клетки: ответ на развернутый белок, импорт белка во внешнюю мембрану митохондрий, сборка белковых комплексов. В условиях воздействия многих стрессовых факторов, вызывающих нарушение процессов протеостаза, также происходит и снижение комменсалов кишечника [33, 34]. В проведенных нами исследованиях корреляция количества данного белка с количеством Lactobacillus spp. была отрицательной: чем больше данного белка в крови, тем выше уровень стресса и тем меньше количество лактобацилл.
Энтерококки являются одним из важных компонентов микрофлоры кишечника. Ряд препаратов, применяемых в качестве пробиотиков в настоящее время, содержат Enterococcus faecium. Численность энтерококков в кишечнике в норме должна составлять 10⁶ КОЕ/мл. Энтерококки (вместе с лактобациллами), помимо толстого кишечника, колонизируют и тонкую кишку, однако их количество заметно меньше. Enterococcus spp. относят к молочнокислым микроорганизмам, так как они осуществляют метаболизм бродильного типа и ферментируют углеводы с образованием молочной кислоты, которая, в свою очередь, снижает pH среды. Кроме того, энтерококки являются хорошо известными продуцентами антимикробных пептидов (энтероцинов).
При анализе полученных данных была выявлена отрицательная корреляционная взаимосвязь белка CALM2 (кальмодулин) в крови с количеством энтерококков в кишечной флоре. Кальмодулин экспрессируется клетками эпителия практически во всех отделах тонкого кишечника и, вероятно, регулирует концентрацию свободного кальция в клетках микроворсинок. Имеются данные, что повышенное содержание ионов кальция и магния в среде ингибирует выработку энтероцинов и метаболизм энтерококков [35]. Это, вероятно, является одной из возможных причин отрицательной корреляции белка CALM2 в крови и количества Enterococcus spp. в кишечной флоре.