На сегодняшний день технологии секвенирования вошли в список рутинных методов, применяемых во многих областях молекулярной биологии, что позволяет оперативно и достоверно выявлять мутации и генетические вариации вирусов, идентифицировать новые патогены, прогнозировать их эволюционные изменения, отслеживать динамику распространения в популяциях и анализировать филогенетические связи [1–3]. Нанопоровое секвенирование было впервые представлено компанией Oxford Nanopore Technologies (ONT) в 2014 году с устройством MinION [4]. Данная технология обладает множеством уникальных преимуществ, обусловливающих ее востребованность в современной медицине и науке [5]. Благодаря способности секвенировать длинные фрагменты ДНК и РНК стало возможным обнаружение структурных вариаций и эпигенетических модификаций [6–8]. Однако ключевым достоинством данного метода секвенирования является компактность нанопоровых секвенаторов, их способность работать посредством подключения к USB-интерфейсу ноутбука, а также низкие требования к оснащенности лаборатории, что открывает возможности применения данных приборов в различных условиях, включая полевые исследования [9].

Технология нанопорового секвенирования уже оказала значительное влияние на различные области медицины, включая диагностику и лечение генетических заболеваний [10][11], персонализированную медицину [2][12], исследование рака [6][13][14]. Благодаря своей скорости и мобильности нанопоровое секвенирование является значимым инструментом для эпидемиологического надзора и контроля за вспышками заболеваемости [9][15–17]. В частности, в условиях пандемии COVID-19 нанопоровое секвенирование сыграло существенную роль в оперативной идентификации штаммов вирусов и выявлении новых генетических вариаций патогенов [12][17][18]. Также данная технология зарекомендовала себя в качестве надежной альтернативы традиционным методам секвенирования полных геномов вирусов [15][19]. Эти качества особенно значимы в условиях глобальных пандемий и вспышек новых инфекций, поскольку оперативно полученные данные играют решающее значение в процессе принятия решений в области общественного здравоохранения.

Помимо оригинальных платформ третьего поколения от компании Oxford Nanopore Technologies, на рынке присутствует аналогичное по функционалу устройство российского производства — Нанопорус. Данный прибор предназначен для нанопорового секвенирования с использованием оригинальных проточных ячеек от Oxford Nanopore Technologies.

Цель исследования — проведение сравнительного анализа функциональных возможностей секвенаторов третьего поколения MinION и Нанопорус в задаче выявления патогенов в биологическом материале, включая сопоставление таксономического состава, определенного с их использованием, с результатами, полученными на референсной платформе второго поколения MiSeq (Illumina).

В рамках двух этапов исследования было проанализировано 138 образцов архивной ДНК из коллекции лаборатории с известным таксономическим составом и различным титром нуклеиновых кислот возбудителей инфекций ряда таксономических групп (исследованы 14 семейств, 20 родов и 43 вида патогенов вирусной и бактериальной природы, суммарно 169 возбудителей инфекций). Идентификация патогенного состава исследуемого материала была предварительно проведена посредством высокопроизводительного секвенирования на платформе MiSeq (Illumina). На основании данных локального выравнивания нуклеотидных и белковых последовательностей выполняли анализ показателей схожести с последовательностями из базы данных, применяемых для таксономической идентификации.

В ходе подготовки ампликонных ДНК-библиотек применяли следующие наборы реагентов: восстановление концов двуцепочечных фрагментов ДНК и безматричное аденилирование проведено набором реагентов NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (New England Biolabs), лигирование адаптерной последовательности из состава набора PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096) (ONT) проводили с применением реагента Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs), баркодирование библиотек осуществлялось набором баркодов PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096) (ONT). Все наборы использовались согласно инструкции производителя.

Подготовку ДНК-библиотек для секвенирования на проточной ячейке R9.4.1 проводили с применением набора реагентов Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) (ONT) с последующей загрузкой в проточную ячейку. Подготовку ДНК-библиотек для секвенирования на проточной ячейке R10.4.1 проводили набором реагентов Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-NBD114) (ONT) с последующей загрузкой в проточную ячейку. Последовательность применения секвенаторов определяли с учетом технических и методологических соображений. На первом этапе исследования, при первичном использовании проточной ячейки R9.4.1, секвенирование сначала проводили на секвенаторе MinION, который обеспечивал заведомо стабильную работу ячейки. Этот порядок был выбран для минимизации потенциальных рисков, связанных с возможным снижением стабильности или функциональности ячейки после ее применения на секвенаторе Нанопорус. На втором этапе с целью тестирования секвенатора Нанопорус на воздействие на функциональные характеристики ячейки для последующего использования в приборе MinION секвенирование проводили сначала на Нанопорусе, а затем на MinION.

Запись детектируемого сигнала с приборов осуществляли программным обеспечением MinKNOW версии 23.11.4; бейсколинг данных в формате pod5 проводили программой Dorado версии 7.2.13 (ONT). С целью обеспечения корректности сравнения качества секвенирования и таксономической идентификации тестируемыми приборами для каждого образца отбирали одинаковое количество прочтений, представляющих случайную выборку, сформированную посредством биоинформатического инструмента SeqKit (версия v2.8.0). Оценку качества прочтений в формате fastq осуществляли с применением биоинформатических инструментов Trimmomatic (версия 0.32), FastQC (версия v0.12.0). Сравнительный анализ полученных данных (количество последовательностей, средние показатели качества прочтений (Qscore) для каждого нуклеотида, GC-состав последовательностей, распределение длин последовательностей, уровень дупликаций прочтений) проводили биоинформатическим инструментом MultiQC (версия 1.20). Таксономическую идентификацию вирусного состава образцов проводили с использованием программного обеспечения PathogenID (ФМБА, Россия). В качестве референсного инструмента для сопоставления результатов определения таксономического состава образцов использовались данные, полученные на платформе второго поколения (MiSeq, Illumina).

Для проведения сравнительного анализа тестируемых секвенаторов исследуемые инфекционные агенты разделяли на 5 групп в соответствии с показателем таксономической идентификации (% Identity), полученным в результате высокопроизводительного секвенирования. Группам вирусов присваивали следующие идентификаторы: Группа № 1 — 30 патогенов, 100–97% Identity, Группа № 2 — 29 патогенов, 96–94 % Identity, Группа № 3 — 39 патогенов, 93–90 % Identity, Группа № 4 — 35 патогенов, 89–80 % Identity, Группа №5 — 24 патогена, 79–71 % Identity. Представленные группы патогенов моделируют анализ дивергентных групп патогенов, в частности новых штаммов, видов.

С использованием программного обеспечения MinKNOW выполнена оценка стабильности передачи данных с прибора на управляющий компьютер. В ходе анализа графиков, полученных с приборов MinION и Нанопорус с использованием проточной ячейки R10.4.1, значительных флуктуаций и сбоев в передаче сигнала, а также отклонений от равномерного распределения скорости транслокации ДНК через пору не зарегистрировано (рис. 1 А2, Б2). Графики поддержания температурного режима на протяжении всего процесса секвенирования указывали на отсутствие нарушений в работе секвенаторов, колебания температуры были незначительными и оставались в пределах допустимых значений, соответствующие данные представлены на рисунке 1 А1, Б1.

Проведено сравнение показателей качества прочтений, полученных с проточных ячеек как старого, так и нового типа для секвенаторов MinION и Нанопорус (рис. 2). Анализ представленных графиков установил увеличение значения параметра Qscore, отражающего точность идентификации оснований в прочтениях, и снижение уровня дупликаций при использовании проточной ячейки последней версии R10.4.1, также установлено соответствие всех представленных метрик оценки качества прочтений, полученных с двух сравниваемых нанопоровых секвенаторов.

Рассчитаны дополнительные показатели качества секвенирования, а именно метрики N50, N95, N5, а также процент ридов с качеством выше Q20 и Q30, соответствующие данные представлены в таблице 1. В ходе сравнительного анализа процента последовательностей с качеством выше Q20 и Q30 установлено, что при использовании проточной ячейки более ранней версии (R9.4.1) около 70% данных имеют качество ниже Q20 и примерно 97,3% — ниже Q30 на обоих секвенаторах. В то время как при применении проточной ячейки последней версии R10.4.1, доля данных с качеством ниже Q20 составляет менее 55%, а ниже Q30 — менее 76%. Существенных различий в показателях N50, N95, N5, а также в проценте последовательностей с качеством выше Q20 и Q30 между двумя различными приборами третьего поколения не выявлено.

Исследуемый материал содержал фрагменты геномов патогенов следующих семейств: Pseudomonadaceae, Circoviridae, Adenoviridae, Coronaviridae, Orthomyxoviridae, Parvoviridae, Polyomaviridae, Astroviridae, Caliciviridae, Picornaviridae, Solemoviridae, Hepeviridae, Partitiviridae, Tymoviridae.

Семейство Adenoviridae насчитывало 12 образцов и 5 видов патогенов с вирусной нагрузкой от 7,22 до 0,33% прочтений на образец по данным высокопроизводительного секвенирования. В результате обработки данных, полученных приборами MinION и Нанопорус, таксономический состав был подтвержден у 11 (92%) и 10 (83%) образцов соответственно. Семейство Circoviridae насчитывало 35 образцов и 11 различных видов патогенов с вирусной нагрузкой от 57,27 до 0,04% прочтений по данным секвенирования на платформе Illumina. В результате обработки данных с секвенаторов MinION и Нанопорус таксономический состав был подтвержден у 34 (97%) и 33 (94%) образцов соответственно. Несмотря на то что идентификация целевого патогена нанопоровыми секвенаторами была проведена не для 100% образцов, содержащих вирусы данных семейств (Adenoviridae и Circoviridae), в ходе выравнивания нуклеотидных последовательностей на референсные базы данных для ряда образцов было получено более детальное типирование вирусов нанопоровыми данными.

Согласно данным высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina семейство Coronaviridae насчитывало 70 образцов и 9 различных видов патогенов с вирусной нагрузкой от 49,52 до 0,15% прочтений; выборка образцов семейства Orthomyxoviridae насчитывала 6 образцов и 1 вид с вирусной нагрузкой от 28,97 до 1,32% прочтений; выборка образцов семейства Pseudomonadaceae насчитывала 12 образцов и 1 вид; тестируемая группа семейства Parvoviridae насчитывала 15 образцов и 11 видов патогенов с вирусной нагрузкой от 28,12 до 0,22% прочтений; семейство Picornaviridae насчитывало 4 образца и 4 вида патогенов с вирусной нагрузкой от 11,53 до 0,3% прочтений. И так же, как и у семейств Astroviridae, Caliciviridae, Polyomaviridae, Solemoviridae, Tymoviridae, Partitiviridae и Hepeviridae, насчитывающих единичные образцы, идентификация таксономического состава семейств Coronaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae и Orthomyxoviridae проведена у 100% образцов в ходе секвенирования третьего поколения на приборах MinION и Нанопорус. Суммарно нанопоровыми секвенаторами MinION и Нанопорус было идентифицировано 167 (98,8%) и 165 (97,6%) патогенов соответственно.

Для наиболее представленных семейств вирусов проводили сравнение процента прочтений, приходящихся на целевой возбудитель инфекций. Для более доступной визуализации сопоставления данные взяты в логарифмической шкале и проанализированы для трех пар секвенаторов: MiSeq и MinION (A), MiSeq и Нанопорус (Б), а также MinION и Нанопорус (В) (рис. 3). На графиках отмечали возрастание уровня корреляции между результатами секвенирования по мере увеличения вирусной нагрузки в образцах, в особенности между данными нанопорового секвенирования при уровне нагрузки более двух логарифмических единиц. При низкой вирусной нагрузке выявлены отклонения, в частности между данными, полученными на платформе Illumina, и данными секвенаторов третьего поколения.

Для оценки взаимосвязи показателей процентной вирусной нагрузки на трех приборах рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона. Анализ данных, собранных с обеих проточных ячеек, показал следующие результаты: коэффициент корреляции между платформами MiSeq и MinION составлял r = 0,567 (p ≤ 0,05), что указывало на умеренную положительную зависимость. Между MiSeq и Нанопорус зафиксирован коэффициент r = 0,544 (p ≤ 0,05), также свидетельствующий об умеренной положительной связи. Наивысшее значение корреляции наблюдалось между секвенаторами Нанопорус и MinION, равное r = 0,993 (p ≤ 0,05), что указывало на практически полное совпадение результатов между этими двумя приборами.

В ходе исследования сравнивали группы инфекционных агентов, сформированные согласно диапазону таксономической идентичности (% Identity), по средним значениям показателей таксономической идентификации (e-value, % Identity, длина выравнивания (пары нуклеотидных оснований п.о.), процент прочтений целевого вируса), полученным на тестируемых приборах (рис. 4).

Для всех представленных групп патогенов показатели % Identity и e-value, полученные на платформе MiSeq, незначительно превышали аналогичные показатели, полученные на нанопоровых секвенаторах. В то же время показатель длины выравнивания последовательностей демонстрировали обратную зависимость. Гистограммы указывали на высокую степень соответствия показателей выявления инфекционных агентов между тремя приборами.

Для визуализации различий в достоверности таксономической идентификации, обеспечиваемой тестируемыми секвенаторами, проводили моделирование вариационного распределения вирусной нагрузки и процента идентичности на основании данных, полученных с трех приборов (рис. 5). По результатам первого этапа исследования (95 образцов) (A) наблюдали следующую модель распределения показателей: на платформе MiSeq основное скопление данных располагалось в диапазоне высокой идентичности (90–100%) и средней вирусной нагрузки (2–3 логарифмические единицы); при использовании проточной ячейки R9.4.1 платформа MinION демонстрировала плотное скопление данных в области с высокой идентичностью (более 90%) и относительно высокой вирусной нагрузкой (2–3 логарифмические единицы); данные с секвенатора Нанопорус распределялись шире по оси идентичности, однако основное дисперсионное скопление также находилось в пределах 90% идентичности. По результатам второго этапа исследования (43 образца, предположительно содержащих нуклеиновые кислоты малоизученных патогенов) (Б) получили следующий профиль данных: на платформе MiSeq наблюдалось смещение плотности данных в сторону более низкой идентичности и вирусной нагрузки, что объясняется особенностями исследуемого материала; при использовании проточной ячейки R10.4.1 данные с MinION концентрировались в узком диапазоне 85% идентичности и относительно высокой вирусной нагрузки (2–3 логарифмические единицы); секвенатор Нанопорус демонстрировал менее плотное распределение данных относительно показателей своего аналога, но сопоставимую вирусную нагрузку.

Долгое время компания Oxford Nanopore Technologies (ONT) оставалась единственным разработчиком, предлагающим решения в области нанопорового секвенирования. Однако за последний год на рынок вышли несколько аналогичных платформ. В частности, сравнительно недавно были анонсированы китайские секвенаторы: QNome-3841 и QNome-3841hex от компании QitanTech, которые уже нашли применение в задачах судебно-медицинской генетики и исследованиях полных бактериальных геномов [27][28]; CycloneSEQ от компании MGI, показавший существенные результаты в сборке геномов de novo, а также в метагеномном и single-cell секвенировании согласно опубликованному разработчиками платформы исследованию [20]. На момент проведения исследования сравнительный анализ CycloneSEQ и Gnome с системами, такими как MinION, был невозможен ввиду недавнего анонса платформ. Нанопоровый секвенатор Нанопорус, представляющий собой аналог широко известного устройства MinION, был анонсирован в конце 2023 года и введен в коммерческое использование в начале 2024 года. На момент написания исследования авторам не удалось обнаружить в открытом доступе исследований, посвященных прямому сопоставлению характеристик данных приборов, в связи с чем наши выводы основаны исключительно на собственных экспериментальных данных.

В ходе тестирования секвенатора Нанопорус нарушений или отклонений в работе выявлено не было. Подтверждена совместимость прибора с оригинальными проточными ячейками двух последних версий, наборами для подготовки библиотек и программным обеспечением от компании Oxford Nanopore Technologies. Данные о скорости транслокации ДНК через нанопоры не выявили искажений сигнала, что указывает на отсутствие существенных отклонений от ожидаемых показателей качества передачи информации на управляющий компьютер. Показатели устойчивости поддержания температурного режима нанопоровыми секвенаторами свидетельствуют о минимальных колебаниях температуры, что важно для стабильной работы нанопор, обеспечения точности секвенирования, предотвращения деградации библиотеки и поддержания оптимальных условий функционирования ферментов, участвующих в процессе секвенирования. В рамках данного анализа установлено соответствие оборудования заявленным характеристикам и функциональным требованиям.

Обновленная проточная ячейка R10.4.1 значительно улучшает точность и стабильность секвенирования, что подтверждается увеличением средних значений параметра Qscore на обеих нанопоровых платформах по сравнению с предыдущей версией проточной ячейки. Существующие исследования в данной области подтверждают, что последняя версия проточных ячеек от компании ONT обеспечивает значительное улучшение точности и качества прочтений [21]. Согласно предоставленным авторами данным процент пар оснований с качеством прочтений Q15 для проточной ячейки R10.4.1 в шесть раз выше, чем для версии R9.4.1; в случае проведения бактериальной сборки генома авторам удалось собрать 97% генома посредством более ранней версии проточной ячейки, а в случае R10.4.1 это значение увеличилось до 98%. В нашем исследовании наблюдается аналогичное улучшение: доля прочтений с качеством ниже Q20 и Q30 значительно уменьшается; количество низкокачественных прочтений ниже Q20 снижается с 70 до 55%, а ниже Q30 — с 97,3 до 76%. Это указывает на повышение точности и надежности секвенирования с использованием новой химии V14 и проточных ячеек R10.4.1 от ONT.

Секвенирование второго поколения признано высокоточным и достоверным методом детекции нуклеиновых кислот инфекционных агентов благодаря высокому качеству чтения нуклеотидов, что позволяет классифицировать его как ведущую технологию среди альтернативных методов молекулярной диагностики [22]. Однако технология нанопорового секвенирования (ONT) предлагает ряд уникальных преимуществ, таких как компактность и мобильность, что особенно выделяется на фоне сложных оптических систем, необходимых для секвенирования второго поколения. Эти характеристики ONT позволяют эффективно использовать технологию в условиях ограниченных ресурсов и оперативных полевых исследований, что является важным фактором для внедрения данного метода в процессы эпидемиологического надзора.

Ранее проведенные исследования продемонстрировали потенциал ONT в качестве альтернативы высокопроизводительным платформам второго поколения. В частности, в рамках исследования, оценивающего возможности идентификации патогенов бактериальной природы с использованием секвенаторов MinION и Illumina (тип прибора второго поколения не уточняется), на обоих приборах успешно выполнена идентификация вида, серотипов, MLST профилей и подтипов шига-токсина в изолятах Escherichia coli (STEC) [23]. В ходе другого исследования, посвященного идентификации бактериального состава эталонного образца, содержащего 8 различных патогенов, установлено, что производительность классификации на уровне семейства и рода преобладала при использовании MinION. Тем не менее на уровне вида идентификация патогенов оказалась более точной на платформе MiSeq. Важно отметить, что для MinION использовалась проточная ячейка версии R9.4.1 [24]. Ряд других исследований, посвященных оценке эффективности применения разных поколений секвенирования для выявления вирусных патогенов, в частности представителей родов Alphavirus [25] и Adenovirus [26], также демонстрируют лишь незначительное преимущество платформ второго поколения по качеству идентификации в сравнении с результатами, полученными на нанопоровых секвенаторах. Наши данные подтверждают выводы, сделанные в вышеописанных исследованиях, демонстрируя высокую корреляцию между результатами детекции патогенов секвенаторами разных поколений. На приборах MinION и Нанопорус было идентифицировано 98,8 и 97,6% патогенов соответственно из числа инфекционных агентов, детектированных платформой MiSeq. Также установлено, что с увеличением патогенной нагрузки в образце наблюдается повышение уровня сходимости результатов секвенирования второго и третьего поколения. Особенно высокое соответствие отмечается между данными, полученными с платформ MinION и Нанопорус по мере превышения среднего значения титра нуклеиновых кислот патогенов в исследуемых образцах. В связи с этим ct MinION и Нанопорус можно считать взаимозаменяемыми в контексте задач по идентификации и количественной оценке патогенов.

В ходе исследования проведена оценка способности нанопоровых секвенаторов выявлять новые или малоизученные вирусные вариации. В выборке исследуемого контрольного материала присутствовали образцы, для которых предварительная идентификация патогенного состава с использованием платформы MiSeq выполнена с низкими показателями качества выравнивания, что может свидетельствовать об ограниченной представленности данных вариаций патогенов в существующих базах данных или на полное отсутствие информации о них. Анализ дисперсионного распределения и параметров качества таксономической идентификации демонстрировал значительное соответствие данных второго и третьего поколения. Это свидетельствует о способности нанопоровых секвенаторов MinION и Нанопорус выявлять ранее неизвестные или малоизученные вирусы на уровне, сопоставимом с высокопроизводительными платформами.

Устройство Нанопорус продемонстрировало совместимость с проточными ячейками последних двух версий, наборами для подготовки библиотек и программным обеспечением компании Oxford Nanopore Technologies, что позволяет его интегрировать в существующие лабораторные процессы без необходимости значительных модификаций рабочих протоколов. Результаты сравнительного анализа подтвердили высокий уровень согласованности данных таксономической идентификации патогенного состава, полученных с использованием секвенаторов третьего поколения MinION и Нанопорус, с результатами, обеспечиваемыми платформой второго поколения MiSeq. На основании полученных данных ограничений для применения нанопоровых секвенаторов MinION и Нанопорус в лабораторных исследованиях по обнаружению патогенных микроорганизмов не выявлено.