При приеме внутрь многие лекарственные вещества (ЛВ) могут расщепляться ферментами желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), плохо всасываются в тонком кишечнике и подвергаются метаболизму при первом прохождении через печень. Для таких препаратов используют различные микро- и наноносители на основе липидов с целью их защиты от деградации под воздействием компонентов пищеварительных соков, для контроля высвобождения, в целях корректировки распределения и повышения биодоступности, а также для целенаправленной доставки препарата к месту действия [1]. Модификация лекарственного препарата путем конъюгации с липидами (жирными кислотами, глицеридами и фосфолипидами) позволяет повысить его липофильность и, как следствие, обеспечить увеличение биодоступности [2]. Однако следует иметь в виду, что в этом случае необходимо доказать, что препарат, конъюгированный с липидами, как минимум так же эффективен, как и оригинальный препарат. В некоторых случаях возможно повысить биодоступность лекарственного препарата за счет поверхностно-активных веществ. Например, капрат натрия может способствовать повышению биодоступности некоторых лекарственных препаратов за счет увеличения проницаемости через кишечный эпителий путем парацеллюлярного транспорта [3].

В последние несколько лет активно изучается возможность разработки лимфатических систем доставки различных препаратов энтерально, минуя эффект «первого прохождения» через печень [4–6]. Такой путь поступления может способствовать увеличению биодоступности. Данная стратегия особенно интересна для доставки антигенов в лимфатические узлы и повышения адаптивного иммунного ответа, вызванного вакцинами. Традиционная системная химиотерапия требует использования высоких доз препаратов и является зачастую неэффективной для их доставки в лимфатическую систему. Разработка носителей для лекарственных препаратов, нацеленных на лимфоциты — уникальная возможность повысить эффективность терапии против ВИЧ/СПИД [7].

В настоящее время известно большое число разнообразных носителей, которые могут быть перспективными для лимфатической доставки лекарственных препаратов (рис. 1). При этом носитель должен длительное время циркулировать в крови, удерживать лекарственное средство до тех пор, пока не будет достигнуто его накопление в органе-мишени [8–10]. Кроме того, включенное в носитель ЛВ не должно терять свою активность во время циркуляции. При выборе носителя лекарственного вещества следует помнить, что эффективность интернализации в клетке зависит от его размера, формы и заряда. Например, наноразмерные носители лучше контактируют с биологическими мембранами, чем эти же носители микронного размера [9]. Системы доставки ЛВ на основе полимеров не всегда являются подходящими кандидатами для лимфатической доставки. Некоторые заряженные полимеры (например, хитозан) могут связываться с клетками слизистой оболочки кишечника за счет нековалентных электростатических взаимодействий, водородных связей и ван-дер-ваальсовых сил [11].

Из всех наноносителей на основе липидов наиболее перспективными являются липосомы, поскольку по сравнению с другими наночастицами на основе липидов они позволяют не только инкапсулировать и защищать лекарственные препараты от деградации, но и усиливать их всасывание в кишечнике [4][12].

Липосомы — это везикулярные системы доставки сферической формы, содержащие в составе липиды, в которых фосфолипидный бислой расположен между двумя гидрофильными слоями [13].

Механизмы доставки макромолекул, «упакованных» в липосомы, по-видимому, могут различаться в зависимости от размеров липосом. Микрочастицы, в том числе гигантские липосомы, имеющие линейные размеры, близкие к размерам хиломикронов, не способны проникать в кровеносные капилляры, размер пор которых составляет около 60 нм. При этом возможность прохождения микрочастиц через слизистый слой кишечника экспериментально подтверждена на лабораторных грызунах как для бионедеградируемых частиц латекса или полистирола [14][15], так и для крупных липосом размером до 10 и более микрометров [16]. В качестве одного из возможных путей, по которому микроразмерные частицы проникают через кишечный барьер, рассматривается поглощение их через микроскладчатые (microfold) М-клетки. Несмотря на то что популяция М-клеток среди общего числа клеток невелика (~1%), их положение и особенности микроокружения таковы, что они способны обеспечивать трансцитоз микрочастиц, бактерий, вирусов, липополисахаридов и т.п. Это связано с особенностями их структуры и микроокружения (уменьшенная плотность гликокаликса, меньшая выраженность щеточной каймы и микроворсинок), что обусловливает их способность поглощать микрочастицы, размеры которых превышают 200 нм — максимальный размер липидных комплексов (мицелл), способных поглощаться энтероцитами. Считается, что главной функцией М-клеток является доставка антигенов для последующего процессинга и их представления гетерогенной популяции лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток, составляющих комплекс клеток иммунной системы, ассоциированных с желудочно-кишечным трактом (ЖКТ). Вместе с тем известно, что доставка, например, циклоспорина А в крупных липосомах (~10 мкм) при внутрижелудочном введении крысам приводит к увеличению биодоступности этого лекарственного препарата более чем в 9 раз [16][17]. Следует отметить, что, например, для белковых антигенов данный путь доставки является наиболее перспективным, поскольку в этом случае доставка антигена происходит непосредственно в лимфоидную ткань ЖКТ. При переходе крупных липосом в результате трансцитоза в подслизистый слой часть из них может по лимфатическим сосудам попадать и в другие части сосудистой системы, в том числе системный кровоток.

Цель исследования — изучение перспектив применения липосом первого поколения (без холестерина) из соевого лецитина в качестве носителя для возможной лимфатической доставки биологически активных веществ.

В настоящей работе использовали соевый лецитин (Ультралек Р, ADM, США), рекомбинантный зеленый флуоресцентный белок zFP506 (ZsGreen1), полученный в трансфицированных плазмидой pAAV-ZsGreen1 Vector (Takara Bio) клетках HEK293 (Thermo Fisher), гексан (чда, «Вектон», Россия), 0,05 М раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (чда, «Вектон», Россия), 0,05 М раствор однозамещенного фосфорнокислого натрия, 0,1 М хлористоводородная кислота («Вектон», Россия), 0,01 М фосфатно-солевой буфер (PBS) — pH 7,3, содержащий 0,137 М NaCl и 0,0027 М KCl («Биолот», Россия), раствор Дульбекко без Ca и Mg («Биолот», Россия), бычий сывороточный альбумин (BSA) (Sigma-Aldrich), формалин нейтральный 10% («Синтакон», Россия).

В круглодонной колбе 100 мг соевого лецитина растворяли в 20 мл гексана, служившего в качестве растворителя. Полученную смесь выпаривали на роторном испарителе (Heidolph, Германия) до образования тонкой пленки (температура водяной бани 45 °С, давление 65 мбар). Зеленый флуоресцентный белок (GFP) из исходного раствора доводили до концентрации 5 мг/мл в 50 мл 0,01 М натриевого фосфатного буфера (pH 7,4). Включение белка в липосомы происходило пассивно при формировании липосом из полученного раствора GFP в колбе при постоянном перемешивании на магнитной мешалке (Heidolph, Германия) при 400 об/мин (4 ч при комнатной температуре) до полной регидратации пленки со стенок. Полученные липосомы центрифугировали на центрифуге (Heidolph, Германия) при скорости вращения ротора 20 000 об/мин в течение 15 мин для осаждения полученных липосом, отбирали надосадочную жидкость и однократно промывали деионизированной водой.

Для оценки эффективности включения белка в состав липосом определяли содержание белка по методу Лоури в соответствии с ОФС.1.7.2.0023.15 в растворе до и после формирования липосом. Концентрация белка в растворе снижалась после завершения процесса примерно на 60% по сравнению с исходной, что должно соответствовать эффективности включения GFP.

Раствор хитозана в концентрациях 1, 0,5 и 0,1% готовили путем растворения сухих навесок в 1%-ном растворе уксусной кислоты. Контроль pH полученных растворов осуществляли при помощи pH-метра, pH полученных растворов составил 5,4.

В круглодонной колбе 100 мг соевого лецитина растворяли в 20 мл гексана. Полученный раствор лецитина выпаривали на роторном испарителе (Heidolph, Германия) до образования тонкой пленки (температура водяной бани 45 °С, давление 65 мбар). Зеленый флуоресцентный белок концентрации 5 мг/мл растворяли в 50 мл 0,01 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,4) и вводили совместно с растворами хитозана выбранных концентраций. Формирование липосом проходило при постоянном перемешивании на магнитной мешалке (Heidolph, Германия) при 400 об/мин в течение 4 часов при комнатной температуре до полной регидратации пленки со стенок. Полученные липосомы центрифугировали (Heidolph, Германия) при 20000 об/мин в течение 15 мин, удаляли надосадочную жидкость и однократно промывали водой.

Проведена конфокальная микроскопия (микроскоп Zeiss «LSM 710», CarlZeiss, Германия; увеличение ×63) с аргоновым лазером λ = 488 нм. В исследуемых образцах для визуализации липосом в качестве модельного белка использовали GFP с максимумом флуоресценции при длине волны 506 нм.

GFP выделяли из клеточного экстракта HEK293, трансфицированных плазмидой pAAV-ZsGreen1 Vector (Takara Bio) с использованием метода спиртовой экстракции и осаждения сульфатом аммония, описанного в статье [18].

Работа проведена с использованием мышей самок линии Balb/c, распределенных на 3 группы по 3 мыши:

группа 1 — контрольная группа;

группа 2 — животные получали нативный флуоресцентный белок;

группа 3 — животные получали суспензию с исследуемой конструкцией (липосомы без хитозана, содержащие GFP).

Выбор такого количества подопытных животных в группах является достаточным для оценки характера и частоты проявления регистрируемых эффектов. Возраст животных к началу эксперимента составлял 11–13 недель, масса тела не отклонялась от среднего значения по всем экспериментальным группам больше чем на 20%.

Подопытным мышам вводили липосомы без хитозана с GFP или водный раствор GFP в соответствии с описанием, приведенным выше. В контрольной группе были интактные мыши. В полученных от животных клеточных суспензиях оценивали наличие флуоресцентного свечения GFP методом проточной цитометрии.

Процедура внутрижелудочного введения выполнена квалифицированными специалистами с использованием зонда. Объем введения был одинаков для всех животных и составлял 300 мкл. Концентрация GFP в водном растворе, использованном для введения мышам, определена методом Лоури и составляла 0,86 мг/мл. Такой же раствор GFP использовали при изготовлении липосом. В исследуемых образцах эффективность включения GFP в липосомы составила не менее 60%.

Через 3 ч после введения раствора GFP или липосом с GFP мыши были подвергнуты эвтаназии путем цервикальной дислокации. После вскрытия брюшной полости извлекали фрагмент тонкой кишки длиной 2 см на удалении 1 см от желудка и переносили в отдельную пробирку объемом 5 мл, содержащую PBS.

От каждого фрагмента кишки отделяли часть длиной в 1 см и разрезали вдоль, чтобы получить препарат прямоугольной формы.

Неразрезанные фрагменты тонкой кишки длиной 1 см отмывали в PBS, разрезали на фрагменты длиной 0,5 см и заключали в гель Tissue-Tek® O.C.T. Compound (Sakura Finetek, Япония), наполняя гелем изнутри для сохранения структуры криосрезов. Образцы замораживали в жидком азоте и нарезали при помощи криотома (SLEE medical, Германия). Криосрезы толщиной 10 мкм помещали на предметное стекло, дважды промывали PBS и фиксировали в нейтральном формалине (3,7%) в течение 30 мин. Фиксированные образцы дважды промывали PBS и пермеабилизовали 0,1% раствором Triton X-100 на PBS с 1% BSA в течение 30 мин, после чего дважды промывали PBS с 1% BSA.

Для визуализации клеток при конфокальной микроскопии F-актин клеточного цитоскелета окрашивали флуоресцентным красителем Alexa Fluor 594 phalloidin (Invitrogen, США), разведенным в PBS с 1% BSA в соотношении 1:40, затем 30 мин и инкубировали в темноте. После этого образцы дважды промывали PBS с 1% BSA и заключали в ProLong Gold antifade reagent (Invitrogen, США). Хранили препараты в темноте при температуре 2–6 °C.

После отмывки препарата от слизи и крови в кювете с раствором PBS его переносили на клеточное сито с сечением ячеек 40 мкм с внесенным в него 1 мл раствора Дульбекко («Биолот») и получали клеточную суспензию путем протирания. Затем суспензию дважды отмывали раствором Дульбекко с центрифугированием (8 мин, 800 об/мин). Отмытый осадок клеток ресуспендировали в объеме 400 мкл раствора Дульбекко.

Анализ клеточной суспензии проводили на проточном цитофлуориметре CytoFLEX в конфигурации V5-B5-R3 (Beckman Coulter, США). Для каждого образца набирали по 50 000 событий (для контрольных образцов не менее 20 000) в режиме скорости подачи образца 10 мкл/с.

Подсчет количества клеток, содержащих GFP, проводили с использованием стандартных детекторов прямого и бокового светорассеяния (для определения морфологических характеристик клеток: линейного размера и сложности внутриклеточной структуры соответственно), а также пригодного для визуализации GFP светофильтра (канал FITC).

В ходе работы методику формирования липосом выбирали по следующим критериям.

В настоящее время существенно расширен спектр различных модифицированных липосом. Считается, что полимерные покрытия повышают способность липосом преодолевать эпителиальный барьер. Для этого широко используются хитозаны и их производные. Хитозан при взаимодействии с мембранными белками способен стимулировать конформационные изменения белковых молекул, которые могут приводить к увеличению парацеллюлярного транспорта биологически активных молекул. Вместе с тем далеко не всегда нанесение на липосомы гидрофильных полимеров приводит к положительному эффекту (например, не всегда достигается защита от деградации таких липосом пищеварительными ферментами). Липосомы, имеющие в своем составе хитозан, чувствительны к изменению pH и могут агрегировать в желудочно-кишечном тракте, что, в свою очередь, может стать причиной снижения всасывания препарата. Эффект был продемонстрирован на примере перорального введения циклоспорина А, включенного в липосомы, модифицированные хитозаном [19].

В ходе работы были сформированы два варианта липосом: со встроенным в липосомы хитозаном (для повышения мукоадгезивных свойств) и без модификации. В исследовании были апробированы несколько концентраций полимера (1%-, 0,5%-, 0,1%-ный раствор хитозана в уксусной кислоте). Как оказалось, введение хитозана в состав липосом во всех выбранных концентрациях может приводить к их сильной агрегации (рис. 2А), что существенно уменьшает перспективы их использования в качестве системы доставки. Наиболее логичным решением проблемы агрегации может стать применение ультразвукового воздействия на частицы в ходе их формирования. Однако, согласно выбранным нами критериям формирования липосом, такое воздействие недопустимо. Поэтому в дальнейшем нами для исследований in vivo была выбрана система доставки без каких-либо модификаций. Размеры полученных липосом без хитозана имели стабильный линейный размер 1–5 мкм (рис. 2Б), агрегация при этом отсутствовала.

При анализе результатов цитофлуориметрии за уровень аутофлуоресценции по каналу FITC, которая всегда присутствует в биологических объектах, приняли значение, соответствующее группе контроля, — оно составляло около 1% от родительской популяции клеток во всех исследованных образцах (рис. 3А). В образцах клеточных суспензий от мышей из группы, получившей GFP без липосом, количество событий, соответствующих флуоресценции GFP, не превышало уровня аутофлуоресценции в контроле (рис. 3Б).

В образцах клеток кишечника, полученных от животных из группы, получивших GFP в липосомах, наблюдали существенное увеличение событий, соответствующих свечению GFP, — до 8–10% от родительской популяции клеток (рис. 3В).

Методом конфокальной микроскопии показано, что молекулы GFP, упакованные в липосомы, не разрушаются в желудке и могут быть доставлены в клетки кишечника (рис. 4В). Перспективы дальнейшего использования примененной системы доставки зависят от эффективности действия упакованного в липосомы ЛВ и его физико-химических характеристик. Кроме того, в дальнейшем предполагается модификация липосом нанесением Pluronic 127 на их оболочку. Известно, что данный лиганд способствует улучшению захвата липосом энтероцитами и повышению стабильности липосом. Подобная модификация может позволить повысить поглощение системы доставки клетками и обеспечить эффективный транспорт по лимфатической системе. При пероральной доставке циклоспорина А липосомами с Pluronic 127 была продемонстрирована хорошая стабильность системы доставки в желудочно-кишечном тракте. Выбранный носитель достигал поверхности эпителия, что приводило к высокому всасыванию препарата [19].

Эффективность доставки макромолекул в составе липосом при приеме внутрь до сих пор не может считаться удовлетворительной. Улучшение доставки липосом в клетки остается одной из важных проблем, которым посвящены текущие научные исследования [20]. Авторами данного исследования использованы наноразмерные липосомы, содержащие холестерин, для доставки мРНК, кодирующей GFP, в клетки Caco-2, часто применяющиеся в качестве модели при оценке доставки ЛВ путем трансцитоза. Публикаций, посвященных доставке макромолекул в составе липосом на биомодели in vivo, практически нет. Полученный в ходе нашего исследования результат важен именно с позиции практической оценки применения липосом для доставки макромолекул через ЖКТ.