Аддитивные технологии, в число которых входит 3D-печать, являются движущей силой крупных инноваций во многих областях науки, в том числе в медицине и биологии.

В качестве материала для печати используются различные полимеры природного и синтетического происхождения, а созданные на их основе конструкции могут стать базой для изготовления функциональных трехмерных тканей [1]. Эти биоматериалы называются чернилами, они имитируют состав тканей человеческого или животного организма. Преимуществом 3D-печати является возможность воспроизведения геометрии трехмерной структуры, которая более похожа на естественную биологическую систему, чем двухмерная in vitro модель. Структурное сходство напечатанной конструкции может привести к более физиологически релевантным функциональным результатам. Ни одна другая технология не может обеспечить такого уровня геометрической сложности и подобия живым тканям [2].

3D-печать может применяться для создания объемных трехмерных носителей, обеспечивающих трехмерное культивирование клеток с целью их дальнейшей трансплантации в поврежденные органы и ткани [2]. Напечатанные конструкции вместе с культивируемыми на них клетками могут быть использованы в качестве моделей тканей для тестирования новых лекарственных препаратов [3].

Параметры биопечати можно определить как настройки биопринтера (входные данные встроенного программного обеспечения — ПО), которые необходимы для правильного создания 3D-печатных структур. В этом смысле для 3D-печати подходит только определенный диапазон значений, а их выбор является ключевым фактором для получения жизнеспособных структур. Эти значения зависят от состава чернил, который следует тщательно подбирать в каждом конкретном случае [4].

К основным параметрам печати относят температуру диспенсера, температуру подложки, скорость печати и параметры входящего потока (скорость и давление). Скорость печати (движение в плоскости XY) важна, поскольку она напрямую связана с общим временем 3D-печати. Кроме того, при методе экструзионной печати поток гидрогеля (ширина нити) контролируется преимущественно за счет скорости печати и скорости ретракции. Используемые значения скорости печати варьируют от 0,2 до 150 мм/с, но наиболее часто находятся в диапазоне 1–30 мм/с [4].

Точные размеры напечатанной 3D-структуры сохраняются при правильном выборе входящего потока, который указывается в процентах. Этот параметр отвечает за количество чернил, экструдируемых принтером. Калибровка входящего потока также улучшает настройки ретракции [4].

К основным свойствам чернил для 3D-печати относятся пригодность для печати, вязкоупругие свойства, биодеградируемость, цитосовместимость [5]. 3D-матрица должна имитировать биологическую среду и облегчать клеточное прикрепление, пролиферацию и рост клеток, способствовать диспергированию биоактивных молекул и факторов роста, а также содержать пространство для размещения внеклеточного матрикса [6].

В качестве чернил могут использоваться как природные, так и синтетические полимеры, однако предпочтение отдается природным материалам из-за их высокой биосовместимости, хотя они часто обладают недостаточными механическими свойствами [7]. Наиболее часто применяемыми компонентами в чернилах являются хитозан и альгинат, далее — желатин, гиалуроновая кислота, фиброин шелка и полиэтиленгликоль [8]. Гидрогели могут имитировать, например, модуль упругости мягких тканей человеческого тела. Для самых прочных тканей, таких как кости или зубы, требуются другие материалы — термопластичные полимеры с добавлением гидрогелей [8].

Хитозан является одним из перспективных материалов для 3D-печати. Хитозан имеет три типа реакционноспособных функциональных групп: аминогруппы, а также первичные и вторичные гидроксильные группы в положениях С-2, С-3 и С-6 соответственно. Положительный заряд его функциональных групп делает хитозан единственным положительно заряженным природным полисахаридом. Следовательно, хитозан может взаимодействовать с отрицательно заряженными биомолекулами, липидами, белками, дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) и различными клеточными рецепторами, которые запускают каскад взаимосвязанных реакций в живых организмах, что обусловливает его уникальные характеристики [9]. Примером таких характеристик биочернил на основе хитозана являются хорошее взаимодействие клеток и матрицы, имитация структуры нативной ткани, создание микросреды для обмена кислородом и питательными веществами, а также благоприятный иммунный ответ после имплантации.

По данным авторов J. Huang, H. Fu et al., 3D-печатные структуры проявляли биомолекулярную адаптацию, стабильную биосовместимость и биологическую активность даже после различных постпечатных модификаций [10]. Однако хитозан обладает и некоторыми недостатками, такими как медленная скорость гелеобразования, термолабильность и низкая механическая прочность материалов на его основе.

Важно отметить, что физическая стабильность и механическая прочность чернил для 3D-печати зависят от их вязкоупругих свойств. Обеспечить вязкоупругие свойства хитозана можно за счет физических или химических методов сшивания, а также путем добавления дополнительных компонентов. Поэтому хитозан часто структурно армируется другим биополимером, в том числе полисахаридами. В качестве такого армирующего биополимера может быть использован крахмал [11]. Крахмал состоит из углеводов и обладает такими свойствами, как гидрофильность, биосовместимость, низкая стоимость, хорошая биоразлагаемость и нетоксичность [12]. Крахмал состоит из зернистой формы с линейной амилозой и большим количеством разветвленного амилопектина. Структура крахмала является полукристаллической, в которой добавление ограниченного количества воды и обработка теплом и сдвигом приведут к разрушению водородной связи. На этой стадии крахмал расплавится, и это приведет к образованию термопластичного крахмала. Таким образом, мы предположили, что сочетание таких биосовместимых и биодеградируемых биополимеров, как хитозан и крахмал, компенсирует недостатки каждого биополимера в отдельности, а их совместное использование позволит получить чернила с оптимальными характеристиками для формирования носителей с заданными структурными характеристиками методом 3D-печати. Для получения прогнозируемого результата, а именно матриц с заданными структурными характеристиками, такими как размер и высота ячеек, необходимо определить оптимальное соотношение хитозана и крахмала, а также точные параметры печати.

Цель исследования — разработка биосовместимых чернил с оптимальным соотношением хитозана и крахмала, пригодных для 3D-печати.

Для получения чернил использовали хитозан (BiologHeppe, Германия) с молекулярной массой 164 кДа и степенью деацетилирования 92,5% и крахмал (9005-25-8, ХЧ, Merck, Германия).

В работе использовали мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из жировой ткани кролика по методике [13][14] и предоставленные Центром клеточных технологий Института цитологии РАН. Жировую ткань промывали в фосфатно-солевом буфере, затем обрабатывали коллагеназой и после инактивации коллагеназы клетки центрифугировали. Культивирование клеток проводили в питательной среде α-MEM (модифицированная среда «Игла») с добавлением L-глютамина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки и антибиотиков 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (все реактивы Gibco, США). В работе использовали клетки 4–9 пассажей.

Для получения матрицы на основе чистого хитозана и хитозана с добавлением крахмала применяли следующую методику. Хитозан перемешивали с водой при комнатной температуре в течение 15 мин на лабораторной мешалке (OSC-10L, Россия) при скорости перемешивания 1000 об/мин для получения суспензии, в которую затем добавили уксусную кислоту (в концентрации 97%, 2% от объема раствора), а также крахмал в концентрации от 0 до 6%.

Состав перемешивали в течение 1,5 ч на лабораторной мешалке (OSC-10L, Россия) со скоростью 1000 об/мин до полного растворения хитозана. Растворы с добавлением крахмала в течение 15 минут дополнительно перемешивали при температуре 100 °C на водяной бане для набухания крахмала. Объем хитозана, крахмала и уксусной кислоты рассчитывали в массовых процентах. Содержание хитозана и крахмала в растворе варьировали. Составы растворов представлены в таблице 1. Названия растворов представлены в формате Х/К (4/0), где Х — хитозан, К — крахмал, а в скобках — концентрация хитозана/концентрация крахмала.

Зависимость сдвиговой вязкости гидрогелей от скорости деформации измеряли на реометре AntonPaar (модель Physica MCR-301, Австрия) в измерительном узле конус/плоскость СP25 [d = 1 mm] в сдвиговом и динамическом режимах в режимах падения и роста скорости деформации (круговой частоты). Проведен тест на релаксацию вязкости при двух скоростях сдвига: 100 и 0,01 с–1.

Для получения трехмерных матриц применяли метод экструзионной 3D-биопечати. В работе использовали 3D-биопринтер фирмы Rokit Invivo (Республика Корея), в котором установлено программное обеспечение Android OS.

Для создания дизайна объемной матрицы использовали компьютерную программу для проектирования Autodesk Fusion 360, в которой создали параллелепипед со сторонами 16, 10 и 0,2 мм.

Для задания настроек 3D-принтера и преобразования созданной модели в G-код использовали программу для слайсинга NewCreator K.

Скорость печати (мм/с) — это линейная скорость движения печатного столика. Входящий поток (%) — это давление, оказываемое на гель в шприце. Выбранные параметры печати представлены в таблице 2.

В результате 3D-биопечати получали объемные матрицы. Далее их осаждали в 10% растворе гидроксида натрия в течение 5 мин, после чего промывали дистиллированной водой для удаления остатков щелочи. После этого обрабатывали 96% этанолом для дополнительной стерилизации и еще раз промывали дистиллированной водой.

Основным параметром, описывающим качество печати, в данной работе является пригодность для печати (strand printability, SP), которая рассчитывается по формуле 1:

где Dexp — экспериментальный диаметр напечатанных полос (мм);

Ds — теоретически найденный стандартный диаметр (мм).

Экспериментальный диаметр напечатанного волокна измеряли в программе ImageJ. Затем рассчитывали пригодность для печати по формуле 1.

Результат печати считали удовлетворительным при SP = 1 ± 0,1 [12].

В качестве стандартного диаметра Ds принимали диаметр сопла печатающей головки, равный 0,9 мм.

Измерение Dexp проводили 30 раз для каждого образца на разных участках матрицы с помощью программы ImageJ. Значения диаметра получали путем сравнения измеренной величины с эталоном.

Для исследования биосовместимости печатных конструкций проводили посев культуры мезенхимальных стволовых клеток кролика на все напечатанные матрицы. Для этого в каждую чашку Петри добавили по 300 мкл суспензии с клетками с концентрацией 5×105 мкл–1. Далее инкубировали при 37 °С в течение 40 мин. После этого к каждому образцу добавляли по 8 мл готовой питательной среды, содержащей питательную среду α-MEM (модифицированная среда «Игла») с добавлением L-глютамина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки и антибиотиков (100 ед./мл) пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (все реактивы Gibco, США).Культивирование клеток осуществляли в асептических условиях при постоянной температуре 37 °С, концентрации СО2 5% и влажности 98%. Для анализа взаимодействия клеток с матрицами были сделаны фотографии через 1 ч, 1, 3 и 7 дней от начала исследования. Все эксперименты проводились в 3–5 повторностях. Прижизненная визуализация клеток проведена с помощью фотофиксации камерой Nikon (США); размерная шкала 200 мкм.

Статистический анализ выполнен с использованием программного обеспечения Microsoft Excel, для оценки статистически значимых различий между конкретными образцами использовали t-тест Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Данные динамической вязкости образцов с разной концентрацией хитозана и крахмала демонстрируют увеличение вязкости раствора полимера с увеличением в растворе концентрации хитозана, а также концентрации крахмала, что вполне естественно (рис. 1). Переход от высокой скорости сдвига (100 с–1), которая имитирует движение раствора полимера в сопле экструдера, к низкой скорости сдвига (0,01 с–1), которая имитирует состояние раствора на столике печатного устройства, демонстрирует наиболее высокую способность восстановления и сохранения формы изделия для состава Х/К (6/6).

В первой части эксперимента изменяли скорость печати при постоянном входящем потоке. Во второй части изменяли величину входящего потока при постоянной скорости печати.

На рисунках 2–5 изображены гистограммы, с помощью которых визуально оценивали отношение стандартного диаметра, то есть диаметра сопла (0,9 мм, светлые столбцы), к экспериментальному диаметру (яркие столбцы). Гистограммы с голубыми столбцами 2А — с изменяющейся скоростью, с фиолетовыми 2Б — с изменяющимся входящим потоком. Над столбцами подписаны значения среднего экспериментального диаметра с учетом погрешности. Над гистограммами — фотографии исследуемых образцов. Их делали с одинаковой высоты рядом с миллиметровой бумагой, что позволяет оценить реальные размеры матрицы и рассчитать экспериментальные диаметры.

Результаты показали, что наиболее приближенные значения экспериментального диаметра к стандартному для раствора с содержанием хитозана 4% и крахмала 4% (Х/К– 4/4) удалось получить при установке скорости печати 3 мм/м, а входящего потока — 50%. Соответствующие данные представлены на рисунке 2.

Для раствора Х/К (6/0) точное значение экспериментального диаметра было достигнуто только при установке скорости печати 3–5 мм/с и входящего потока 100%. Как и в предыдущем случае, данный диапазон можно считать достаточно узким. Соответствующие данные представлены на рисунке 3.

Для раствора Х/К (4/4) получили широкий диапазон настроек, при которых экспериментальный диаметр достаточно близок к стандартному: 3–5 мм/с при 150% входящего потока и 5 мм/с при 175% входящего потока. Данные представлены на рисунке 4.

Значение экспериментального диаметра в образце Х/К (6/6) оказалось самым стабильным (рис. 5) при изменении параметров печати. Таким образом, достаточно точной печати (близости реальных размеров теоретическим) можно добиться при установке скорости печати от 3 до 7 мм/с при величине входящего потока от 125 до 150%.

В таблице 3 представлены результаты вычислений пригодности для печати всех образцов.

Приемлемыми считали значения, близкие к 1,0 ± 0,1. Во всех группах наблюдали снижение пригодности для печати до 0,9 при увеличении скорости печати или снижении входящего потока, а в предельных случаях — нарушение целостности печатаемой конструкции. При понижении скорости печати и повышении входящего потока экспериментальный диаметр становится больше приемлемого, то есть значение пригодности для печати превышало 1,1. В некоторых случаях встречается слияние полос, что делает невозможным определение экспериментального диаметра и пригодности для печати.

Можно считать удовлетворительным результат при повышении скорости печати до 5 мм/с (p < 0,01) при том же значении входящего потока. Следовательно, наблюдали достаточно узкий диапазон настроек, при котором экспериментальный диаметр близок к стандартному.

При установке значения входящего потока меньше среднего (25%, p < 0,001) зафиксировали превышение экспериментального диаметра над стандартным, что не соответствует результатам всех остальных групп. Данное отклонение может быть объяснено неравномерным распределением биочернил по площади печатаемой конструкции из-за плохой адгезии к стеклу.

При увеличении входящего потока до 175% (p < 0,0001) экспериментальный диаметр превышает допустимые значения (напечатанные линии толще, чем требуется).

Таким образом, можно сделать общий вывод: при повышении скорости печати и снижении входящего потока независимо друг от друга наблюдали уменьшение толщины печатаемой линии. Обратное отмечали при понижении скорости печати и повышении входящего потока.

Пригодность для печати повышается при одновременном увеличении скорости печати и входящего потока для растворов с более высокой вязкостью (рис. 1), таких как Х/К (4/4), Х/К (6/6). Кроме того, для этих растворов характерен широкий диапазон параметров, при которых пригодность для печати близка к 1, а значит, реальные размеры матриц достаточно близки к теоретическим. Использование растворов с меньшей плотностью (Х/К (4/0), Х/К (6/0)) в качестве биочернил требует более тщательного выбора настроек печати. Для таких растворов удалось подобрать только одно значение входящего потока, при котором пригодность для печати близка к 1.

В течение 7 дней МСК культивировали как на поверхности матриц, так и рядом с напечатанными филаментами.

На рисунке 6 представлены результаты культивирования МСК спустя 1 ч после посева. Возле матрицы Х/К (4/0) и на ее поверхности МСК образуют агрегаты (рис. 6А). На рисунке 6Б видно, что клетки распределены равномерно по поверхности чашки, небольшое скопление присутствует на поверхности матрицы. Наибольшее количество клеток наблюдали на матрице Х/К (4/4) (рис. 6В), при этом клетки были сконцентрированы и не агрегировали. На рисунке 6Г наблюдали неравномерное распределение клеток при их большой концентрации на поверхности матрицы Х/К (6/6).

На рисунке 7 изображены фотографии, сделанные через 1 день после посева. На рисунке 7А наблюдали распластанность клеток на поверхности чашки, в то время как на поверхности матрицы Х/К (4/0) клетки образовывали крупные неприкрепленные агрегаты. В случае использования матрицы Х/К (6/0) (рис. 7Б) отмечали большую концентрацию клеток вблизи поверхности. Как и в предыдущем случае, на самой матрице клеток было значительно меньше. На рисунке 7В наблюдали большое количество не распластанных клеток на поверхности матрицы Х/К (4/4). На чашке Петри клетки распластались на некотором расстоянии от матрицы. Матрица Х/К (6/6) имеет очень неоднородную структуру, что видно на рисунке 7Г, по которой сложно оценить количество клеток. Между напечатанными полосами концентрация клеток низкая.

На рисунке 8 приведены фотографии, сделанные через 3 дня после посева. На рисунках 8А и 8Г наблюдали распластанность клеток на поверхности чашки Петри. На поверхности матриц Х/К (4/0) и Х/К (6/0) (рис. 8А и Б) клетки в небольшой концентрации и не распластаны. На рисунке 8В наблюдали клетки на поверхности матрицы Х/К (4/4) в высокой концентрации. На рисунке 8Г видно, что клетки распластались на расстоянии от поверхности матрицы Х/К (6/0).

На рисунке 9 представлены результаты культивирования МСК спустя 7 дней после посева. На рисунке 9 (А–В) видно, что клетки распластаны по поверхности чашки Петри и плотно прилегают к поверхности образцов по бокам. Таким образом, можно сделать предположение о биосовместимости матриц. С другой стороны, на рисунке 9Г клетки адгезируют на некотором расстоянии от матрицы Х/К (6/6), что делает ее наименее предпочтительной для использования. Клетки не распластались по поверхности ни одной из матриц, но наибольшее их количество наблюдается на матрице Х/К (4/4), что может говорить о положительном результате добавления крахмала.

В результате проведенного исследования были разработаны чернила на основе хитозана и крахмала, подходящие для 3D-биопечати. Показано, что увеличение концентрации хитозана в растворе до 6%, а также добавление крахмала способствует увеличению динамической вязкости и способствует быстрому восстановлению и сохранению формы раствора полимера во времени после его вытекания из сопла экструдера. В процессе выполнения экспериментальной работы подобраны оптимальные параметры печати, а именно скорость и входящий поток, которые позволили создать полимерные матрицы с контролируемыми характеристиками структуры. Предварительные эксперименты in vitro продемонстрировали биосовместимость полученных конструкций по отношению к мезенхимным стромальным клеткам человека, что позволяет рассчитывать на использование подобных полимерных композиций при разработке раневых покрытий для лечения поврежденных кожных покровов.