Основной причиной развития генерализованного судорожного синдрома токсической этиологии по-прежнему являются отравления ингибиторами холинэстераз. К веществам данной группы относятся необратимые ингибиторы, в первую очередь фосфорорганические соединения (ФОС), и обратимые ингибиторы, преимущественно производные карбаминовой кислоты (карбаматы). Карбаматы и ФОС входят в состав агрохимии и бытовой химии (пестициды, инсектициды), используются при производстве пластификаторов и полимерных материалов. Карбаматы активно применяются и в фармацевтической промышленности в составе лекарственных средств [1][2]. Количество пострадавших от отравления ингибиторами холинэстераз (бытовые отравления, отравления агрохимикатами, передозировка лекарственных средств, суициды) составляет в мире по нескольку миллионов в год.

Токсическое воздействие ингибиторов холинэстераз на организм приводит к развитию миоза, бронхоспазма, гиперсекреции, рвоты, аритмии и дыхательной недостаточности, являющихся результатом усиленной мускариновой и никотиновой стимуляции на фоне ингибирования активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ), способствующей накоплению ацетилхолина в синапсах нейронов и развитию холинергического синдрома [3]; дополнительно ингибируются бутирилхолинэстераза, карбоксилэстераза и некоторые другие ферменты [1][4][5]. Проявления интоксикации со стороны центральной нервной системы включают генерализованные судорожные припадки, которые могут длиться более 30 мин и сопровождаться выраженным повреждением нейронов и представителей нейроглиального окружения головного мозга. Далее холинергические проявления дополняются глутаматергической эксайтотоксичностью, прогрессией нейровоспаления и нейродегенерацией, у пострадавших могут длительно наблюдаться стойкие неврологические нарушения [6].

Очевидно, что в целях повышения выживаемости при остром отравлении ингибиторами холинэстераз, а также нейропротекции и предотвращения дисфункции центральной нервной системы в отдаленном постинтоксикационном периоде необходимо быстро и эффективно купировать судороги. Однако существующая антидотная терапия предназначена в большей степени для снижения степени тяжести и предотвращения летальных исходов на самых ранних этапах интоксикации (до развития судорог), эффективность ее применения на фоне активно развивающегося или развившегося судорожного синдрома значительно снижается. В частности, атропин [5] воздействует только на мускариновые, но не на никотиновые холинергические рецепторы [6] и наиболее эффективен при профилактическом введении в первые минуты после воздействия. Оксимы (пралидоксим и другие) рекомендованы как профилактические антидоты, и только при отравлении ФОС [4]. Из препаратов бензодиазепинового ряда, взаимодействующих с рецепторами гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), предпочтение отдается мидазоламу, быстрота действия которого определяется высокими пенетрантными свойствами в отношении гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [5]. Их эффективность может существенно снижаться на фоне значительного падения экспрессии субъединиц рецепторов и структурно связанных с ними белков и ферментов, способных взаимодействовать с данными веществами через 10–20 мин после воздействия [6], что значительно повышает процент рефрактерных (нечувствительных к действию антидота) судорог. Все вышеперечисленное определяет необходимость разработки новых эффективных средств купирования судорожного синдрома при отравлении ингибиторами холинэстераз.

Одним из перспективных направлений является разработка противосудорожных средств на основе производных вальпроевой кислоты. Известно, что вальпроевая кислота участвует в пре- и постсинаптической модуляции ГАМК-ергической передачи сигналов, воздействует на натриевые, кальциевые и калиевые каналы, способна повышать внеклеточный уровень серотонина и дофамина в гиппокампе, модулировать нейрогенез и оказывать нейропротекторное действие [7]. Однако эффективная доза антиконвульсанта при генерализованном судорожном синдроме очень велика (более 150 мг/кг м.т.), что ограничивает его применение в качестве антидота, к тому же высокие дозы вальпроевой кислоты отличаются тератогенным эффектом [8].

Для уменьшения эффективной дозы проводятся разработки новых лекарственных средств на основе вальпроевой кислоты. В частности, разработан вальпромид (VPM), действующий как «пролекарство» (вальпроевая кислота высвобождается в процессе гидролиза в желудке) [8, 9]. При этом VPM рекомендован к применению только при биполярных расстройствах (не как противосудорожное средство) и одобрен только во Франции и Италии (Depamide®) [9]. Разработан валноктамид (VCD) — изомер вальпромида, обладающий собственной терапевтической активностью (биотрансформация с выделением вальпроевой кислоты в организме минимальна). На данный момент VCD входит в состав седативных средств и как противосудорожное средство прошел только фазу IIb клинических испытаний [8]. Синтезирован секбутилпропилацетамид (SPD) — гомолог VCD, показавший в доклинических исследованиях высокую противосудорожную активность на различных экспериментальных моделях, в том числе и в случаях бензодиазепин-резистентных судорог [8]. Эффективность SPD обусловлена значительно большей скоростью проникновения через гематоэнцефалический барьер (в 12 раз быстрее, чем вальпроевая кислота), продемонстрировано, что SPD обеспечивал сохранение когнитивных функций и уменьшал повреждение нейронов [10]. Однако SPD и VCD малорастворимы в воде и применяются в виде эмульсии [11], что неудобно для применения в качестве антидота. Все вышеперечисленные производные вальпроевой кислоты не зарегистрированы в качестве средств купирования генерализованного судорожного синдрома.

Цель исследования — сравнительное изучение противосудорожной эффективности оригинальных субстанций аминоэфиров вальпроевой кислоты при отравлении ингибитором холинэстеразы — фенилкарбаматом.

Оригинальные производные вальпроевой кислоты были разработаны и синтезированы на базе лаборатории синтеза лекарственных препаратов ФГБУ НКЦТ им. С.Н. Голикова ФМБА России. Перечень и структурные формулы тестируемых субстанций представлены в таблице 1.

При проведении экспериментов в качестве тест-системы были использованы беспородные белые крысы-самцы возрастом 3 мес. и массой тела 200–240 г, поступившие из питомника НИЦ «Курчатовский институт» — ПЛЖ «Рапполово», Ленинградская область. Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с правилами1.

На первом этапе проводили оценку острой токсичности и определение средней летальной дозы ТАВК (тропиновый аминоэфир вальпроевой кислоты) и ХАВК (хинуклидинольный аминоэфир вальпроевой кислоты) с использованием экспресс-метода по В.Б. Прозоровскому [12]. Для исследования каждого из соединений экспериментальные животные были разделены на 4 группы по 2 крысы в каждой; производили однократное внутрибрюшинное введение исследуемых растворов (субстанции растворяли в 0,9%-ном растворе хлорида натрия). При изучении острой токсичности для субстанций ТАВК и ХАВК были выбраны следующие дозы: ХАВК 63,1, 79,4, 100,0, 126,0 мг/кг; ТАВК 79,4, 100,0, 126,0, 158,0 мг/кг. В ранее проведенных работах была определена ЛД50 для АВК, равная 170 ± 1,2 мг/кг м.т. [13].

На втором этапе изучали фармакологическую активность субстанций на модели судорог, вызванных обратимым ингибитором холинэстераз — гидрохлоридом замещенного 2[(диметиламино)метил] арилдиметилкарбамата (далее — фенилкарбамат) [14]. Фенилкарбамат вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг м.т. [15]. Формировали следующие опытные группы: группа с изолированным введением фенилкарбамата «Ф» как судорожного агента (n = 8), 3 группы с введением «Ф» и последующим введением исследуемых средств коррекции: Ф+АВК (n = 16), Ф+ТАВК (n = 16), Ф+ХАВК (n = 16). Противосудорожную эффективность субстанций АВК, ХАВК и ТАВК оценивали в двух дозах — 21,5 и 43,0 мг/кг м.т. (по 8 животных на каждую дозу исследуемых веществ).

При выборе эффективных доз исследуемых субстанций и режима введения исходили из принятых в клинической практике дозировок и схем применения у человека вальпроата натрия (Конвулекса®). В качестве основы для расчета эффективной дозы взята средняя дозировка — 7 мг/кг м.т. Межвидовой пересчет доз с человека на крыс производили с использованием стандартных рекомендаций А.Н. Миронова2. Расчет величин тестируемых доз осуществляли с использованием коэффициентов: величина терапевтической дозы для крысы составляла 7,0×39 (коэффициент для человека массой 70 кг) / 6,5 (коэффициент для крысы массой 200 г) ≈ 43,0 мг/кг м.т.

Исследуемые субстанции растворяли в 0,9%-ном растворе хлорида натрия и вводили внутрибрюшинно, с учетом межвидового пересчета доз. Объем вводимого внутрибрюшинно раствора составлял 0,1 мл/100 г. Введение осуществляли в первые минуты после начала судорог 3–4-го уровня по шкале Racine [16], вызванных введением ингибитора холинэстераз.

Учитывали показатели эффективности: латентный период, выраженность и продолжительность судорожного синдрома, летальность. Наблюдение и регистрацию смертельных исходов проводили в течение суток. Летальность оценивали по доле погибших крыс от их общего количества в исследуемой группе после введения судорожного агента в течение суток наблюдения. Выраженность судорожного синдрома в эксперименте оценивали по шкале Racine. Судороги 4-го уровня и выше, эквивалентные генерализованным клонико-тоническим судорогам у человека, относили к категории выраженных. Продолжительность судорожного синдрома измеряли в минутах. Для оценки значимости различий в частоте появления крыс с выраженными судорогами использовали точный критерий Фишера. Сравнительную оценку показателей судорожного синдрома у самцов крыс при отравлении фенилкарбаматом проводили с применением критерия Краскела – Уоллиса. Для выявления различий между отдельными группами, а также изучаемых субстанций с группой «Ф» использовали тест множественного сравнения Данна (post-hoc анализ). Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программы Statistica 13.0 (Statsoft, США).

В ходе работы по определению количественных значений характеристик острой токсичности при внутрибрюшинном введении ХАВК было установлено следующее распределение гибели крыс в каждой дозовой подгруппе: 0, 0, 2, 2 особи, что позволило определить величину ЛД50 для ХАВК на уровне 89,8 ± 7,1 мг/кг; при внутрибрюшинном введении ТАВК — 0, 0, 2, 2 особи, что соответствовало ЛД50, равной 113,1 ± 8,9 мг/кг. Исходя из полученных значений ЛД50 оригинальных аминоэфиров вальпроевой кислоты соединения можно отнести к 3-му классу умеренно токсичных веществ.

На экспериментальной модели судорог, вызванных обратимым ингибитором ацетилхолиэстеразы (фенилкарбаматом) [12][13], установлено, что при введении АВК, ХАВК и ТАВК в двух дозах (21,5 и 43,0 мг/кг м.т.) доля погибших крыс статистически значимо не отличалась от группы животных, получавших судорожный агент, вне зависимости от дозы и регистрируемого временного промежутка. В ходе эксперимента была зарегистрирована гибель 1 животного в группе «Ф» на 30 мин наблюдения и гибель одной крысы при введении ТАВК в дозе 21,5 мг/кг м.т. на 10 мин наблюдения, а также гибель 3 крыс в группе ХАВК в дозе 43,0 мг/кг м.т. на 20 мин наблюдения.

После введения фенилкарбамата доля крыс с выраженными судорогами в группе «Ф» начинала снижаться с 30 мин наблюдения на 14%, и далее к 70 мин судороги у животных не регистрировали. Введение оригинальных аминоэфиров снижало количество животных с выраженностью судорог 4-го уровня и выше (шкала Racine), что соответствует генерализованному судорожному синдрому у человека (табл. 2).

При введении исследуемых субстанций в дозе 21,5 мг/кг м.т. статистически значимое уменьшение доли крыс с выраженными судорогами отмечали в период от 10 до 40 мин наблюдения (табл. 2). При этом в группе Ф+ХАВК животные с выраженными судорогами полностью отсутствовали начиная с 10 мин наблюдения, в то время как в двух других группах противосудорожный эффект наступил в более поздние сроки. Так, у животных в группе Ф+ТАВК на 10 мин выраженных судорог не наблюдали, однако в последующие 20 мин были зарегистрированы случаи клонико-тонических судорог, которые закончились к 40 мин, а в группе Ф+АВК снижение уровня судорог произошло уже к 20 мин наблюдения. Не выявлено статистически значимых межгрупповых различий при сравнении животных, получавших различные субстанции в одинаковый временной промежуток.

В случае введения субстанций в дозе 43,0 мг/кг м.т. противосудорожная эффективность в группах Ф+АВК и Ф+ТАВК в целом совпадала с установленной при меньшей дозе. Однако в группе Ф+ХАВК через 10 мин после введения субстанции количество животных с выраженными судорогами не снизилось по сравнению с группой «Ф». В то же время к 10 мин в группах Ф+АВК и Ф+ТАВК количество животных с судорожным синдромом было статистически значимо ниже, чем в группе с изолированным введением фенилкарбамата.

При оценке общей продолжительности судорог с применением статистической обработки результатов с использованием критерия Краскела – Уоллиса выявлено наличие статистически значимых различий между всеми исследуемыми группами при введении субстанций в обеих дозах (табл. 3).

В ходе анализа при построении квадратичной матрицы апостериорных сравнений (р-значения) продолжительности судорог после внутрибрюшинного введения исследуемых субстанций и в группе фенилкарбамата с использованием post-hoc теста по Данну не выявлено статистически значимых межгрупповых различий.

Наряду с этим при сравнении продолжительности судорог в группе Ф+ХАВК (доза 21,5 мг/кг м.т.) со значениями в группе «Ф» обнаружено статически значимое снижение Me продолжительности судорог на 77% (р = 0,001). Также зафиксирована меньшая Me продолжительности судорог на 57% при сравнении показателя в группах Ф+ХАВК и Ф+АВК на уровне дозы 21,5 мг/кг м.т. (р = 0,041).

При введении субстанций в дозе 43,0 мг/кг м.т. установлены различия во времени продолжительности судорог, сопоставимые с результатами, полученными при изучении эффектов введения меньшей дозы, а именно при сравнении показателя в группе Ф+ХАВК с группой фенилкарбамата (р = 0,001) и межгруппового различия Ф+ХАВК и Ф+АВК (р = 0,039).

Рассчитаны взвешенные по времени суммы баллов интенсивности судорог (AUC, площадь под кривой «судороги в баллах-время»). Погибшие особи из расчетов исключались. Продемонстрировано (табл. 4) наличие статистически значимых различий между показателями AUC при введении субстанций в дозах 21,5 мг/кг м.т. (р = 0,001) и 43,0 мг/кг м.т. (р = 0,001).

Установлено, что при введении субстанций в дозе 21,5 мг/кг м.т. взвешенные по времени суммы баллов интенсивности судорог в группе Ф+АВК были на 77% статистически значимо ниже, чем аналогичный показатель в группе фенилкарбамата (р = 0,041), а в группе Ф+ХАВК — на 93% (р = 0,001) по медиане соответственно. В группе Ф+ТАВК уровень AUC был ниже на 84%, однако не достигал уровня статистической значимости в сравнении с группой «Ф». Статистически значимое снижение показателя AUC зафиксировано также в группе Ф+ХАВК по сравнению с группой Ф+ТАВК, разница составила 78% (р = 0,026).

При введении субстанций в дозе 43,0 мг/кг м.т. отмечено достоверное снижение Ме показателя AUC в группе Ф+АВК на 59% (р = 0,015) и в группе Ф+ТАВК на 79% (р = 0,001) по сравнению с животными, получавшими фенилкарбамат.

На рисунках 1 и 2 представлена динамика медианных значений балльной оценки выраженности судорожного синдрома (от 0 до 6 баллов по шкале Racine) после введения исследуемых субстанций на протяжении 100 мин наблюдения. Введение субстанции ХАВК в дозе 21,5 мг/кг м.т. демонстрировало наиболее благоприятный график зависимости выраженности судорожного синдрома от времени, что соответствует большей противосудорожной эффективности данного соединения. В то время как при введении дозы 43,0 мг/кг м.т. более предпочтительные изменения наблюдали у животных, получивших АВК и ТАВК.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение оригинальных аминоэфиров вальпроевой кислоты в организм на фоне острой интоксикации ингибитором холинэстераз способствовало выраженному снижению продолжительности судорог в первые 10–20 мин от начала воздействия. Наибольшую эффективность продемонстрировал ХАВК в дозе 21,5 мг/кг м.т.: через 10 мин судороги прекращались у 100% животных.

Стандартизированная по времени сумма баллов интенсивности судорог (AUC) в группах, получавших оригинальные аминоэфиры вальпроевой кислоты в обеих дозировках, была значительно ниже по сравнению с группой животных без терапии (только введение фенилкарбамата), что свидетельствует о хорошей эффективности исследуемых субстанций при снижении выраженности не только интенсивных, но и других видов судорог. В целом наименьшее значение медианного уровня AUC (соответственно, наибольшая эффективность) установлено для ХАВК (хинуклидинольный эфир вальпроевой кислоты) при введении в дозе 21,5 мг/кг м.т. Образцы АВК и ТАВК в изученных дозировках были сопоставимы друг с другом по эффективности.

Несмотря на то что статистически значимых различий между исследуемыми группами во всех временных промежутках при изучении летальности не обнаружено, выявленные случаи гибели трех животных на 20 мин эксперимента на фоне применения ХАВК в высокой дозе (43,0 мг/кг м.т.) требуют дальнейшего изучения. Очевидно, что эти случаи могут быть связаны как с токсичностью ХАВК, так и с индивидуальной реакцией отдельных особей на воздействие фенилкарбамата, вне зависимости от применения ХАВК. Кроме того, выраженная эффективность ХАВК в дозе 21,5 мг/кг м.т. позволяет предположить, что возможно дальнейшее снижение дозы без потери эффективности, а доза 43 мг/кг м.т. является избыточной. Ранее установлено, что противосудорожная эффективность вальпроамида в эксперименте на мышах в 3–5 раз выше, чем у вальпроевой кислоты [9], возможно, и в случае ХАВК оптимальная доза также будет значительно ниже и не будет связана с какими-либо проявлениями токсичности.

Поскольку ранее продемонстрировано, что введение АВК животным в эксперименте снижало продолжительность судорожного синдрома эффективнее, чем атропин, являющийся стандартным антидотом при интоксикации ингибиторами холинэстераз [17], разработанные оригинальные производные вальпроевой кислоты следует признать перспективными для дальнейшего изучения и разработки средств купирования судорожного синдрома ингибиторами холинэстераз, в том числе и необратимыми.

1 СП 2.2.1.3218-14 от 28.09.2014 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)».2 Миронов АН. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. М.: Гриф и К; 2012.