Бактерии являются повсеместными обитателями окружающей среды и организма человека и играют жизненно важную роль в поддержании экологического баланса. Среди всех известных бактерий, которые даже не являются патогенами, только около 1% могут вызывать инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом. И.И. Мечников первым указал на возможность проявления патогенных свойств у нормальной микрофлоры человека. При возникновении повреждения кожных покровов на раневую поверхность может попадать как транзиторная, так и резидентная условно-патогенная микрофлора; такие условно-патогенные бактерии, как Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. и Pseudomonas aeruginosa, являются распространенными возбудителями кожных и раневых инфекций [1].

Антибактериальная терапия часто не позволяет преодолеть инфекции, вызванные потенциально патогенной микрофлорой, из-за широко распространенной устойчивости их к антибиотикам [2–6]. Биопленки, образованные прикрепившимися бактериями, еще больше усложняют уничтожение бактерий [7–10]. Помимо увеличения количества резистентных к антибиотикам микроорганизмов, антибактериальная терапия зачастую невозможна для пациентов с все чаще наблюдаемыми аллергическими и токсическими реакциями на лекарственные препараты [11].

Растущая антибиотикорезистентность и ее быстрое распространение представляют собой серьезную угрозу для здоровья человека. В последние десятилетия наблюдается увеличение количества выделяемых из окружающей среды и биоматериала грамотрицательных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, таких как Escherichia coli, Serratia coli, Proteus mirabilis, Pneumocystis pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и грамположительный метициллин-резистентный золотистый стафилококк Staphylococcus aureus (MRSA) [12].

До настоящего времени большинство исследований, направленных на борьбу с инфекциями, вызванными потенциально патогенной микрофлорой, сосредоточены на поиске химических средств, эффективных в отношении бактерий.

Альтернативные подходы к профилактике и лечению гнойных инфекций, основанные на использовании физических факторов, становятся все более актуальными в условиях снижения эффективности антимикробных препаратов из-за развития устойчивости микроорганизмов. Одним из перспективных методов местного лечения с выраженным бактерицидным действием является применение низкотемпературной аргоновой плазмы (НТАП) [13–16]. НТАП представляет собой поток частично ионизированного нейтрального газа макроскопической температуры, получаемый при атмосферном давлении [17]. Поток плазмы несет электроны, ионы, свободные радикалы, возбужденные молекулы и ультрафиолетовое излучение [18][19].

Бактерицидное воздействие плазмы обусловлено синергетическим действием ионизированных элементов и ультрафиолетового излучения, что приводит к формированию окислительного стресса и повреждению ДНК бактерий [20–23]. НТАП обладает выраженным антимикробным эффектом.

Медицинские изделия и оборудование обрабатываются в три этапа: дезинфекция, предстерилизационная очистка, стерилизация. Многоразовые инструменты, аппараты, оборудование и системы после каждого пациента обрабатывают механическим, физическим (термическим), химическим или комбинированным методом. Механический метод обработки заключается в протирании систем, крупногабаритных аппаратов и инструментов, не контактирующих с кровью, салфетками с дезинфицирующим средством. Физический (термический) способ заключается в нагреве в воде температурой 70–80 °С, обработке паром или горячим воздухом (например, паром под давлением обрабатывают постельные принадлежности, воздухом 120 °С дезинфицируют не загрязненные выделениями медицинские изделия из стекла, металлов, силиконовой резины). Химический способ заключается в погружении инструментария в емкости с дезинфектантом. В качестве комбинированного метода используют сочетание физического и химического способов обеззараживания, например обработка инструментов в чистящем растворе одновременно с нагревом. Нетепловая плазма может быть эффективной для стерилизации медицинского оборудования, когда не подходит термическая или химическая обработка [13][24][25].

Сообщается о применении низкотемпературной плазмы для улучшения регенерации кожи в косметологии [26][27]. Показано, что применение НТАП эффективно для заживления ран и снижения болевого синдрома после геморроидэктомии, в том числе за счет выраженного бактерицидного действия [28]. Обработка НТАП ускоряла регенеративные процессы и очищение раны при коррекции поздних гнойно-воспалительных осложнений контурной пластики с применением полиакриламидного геля [29].

Авторами Pierdzioch et al.; Herbst et al. впервые при воздействии НТАП на загрязненные срезы дентина выявлен бактерицидный эффект [30][31].

Благодаря неспецифическому и проникающему действию НТАП может использоваться для снижения микробной контаминации тканей, для локального бактерицидного воздействия на инфицированные раны и снижения интенсивности воспаления в месте ранения.

НТАП обладает рядом ключевых преимуществ, включая высокую неспецифическую бактерицидную активность, низкий потенциал формирования устойчивых форм микроорганизмов. Кроме того, НТАП представляет собой перспективный метод лечения острых и хронических ран благодаря своей относительной простоте, низкой стоимости и отсутствию особых требований к обработке раневых поверхностей.

Цель исследования — оценка выживаемости условно-патогенных микроорганизмов после воздействия факторов НТАП на модели in vitro.

Исследование проведено с использованием клинических штаммов из группы ESKAPE-патогенов: Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, грамположительных бактерий MRSA Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, обладающих множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам по системе EUCAST, дрожжеподобных грибов Сandida albicans и эталонных музейных культур E. coli АТСС 10536, K. pneumoniae subsp. pneumoniae АТСС 700603, Staphylococcus aureus 906, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Enterococcus faecalis АТСС 29212, Enterococcus faecium 9/63, грибов Candida albicans АТСС 24433.

Штаммы микроорганизмов, использованные в работе, были взяты из рабочей коллекции лаборатории микробиологии и паразитологии ФГБУ «ЦСП» ФМБА России. Исследование проведено с использованием паспортизированных музейных культур с подтвержденными биохимическими свойствами, выращенных на плотных агаризованных средах (контроль качества). Эталонные музейные культуры приобретены из национальных и государственных коллекций. Культуры хранили в рабочей коллекции в криозащитной среде в низкотемпературных морозильных камерах при температуре минус 70 °С.

Для выращивания микроорганизмов использовали следующие плотные агаризованные питательные среды: среда Эндо для культивирования E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa; желточно-солевой агар для культивирования S. aureus; энтерококк-агар для культивирования E. faecalis и E. faecium; среда Сабуро для культивирования C. albicans.

В ходе исследования проводили оценку динамического диапазона действия факторов НТАП на выживаемость как отдельных штаммов микроорганизмов из группы ESKAPE-патогенов, так и смеси культур микроорганизмов.

Методика проведения исследования заключалась в следующем. Суточные культуры штаммов микроорганизмов наносили капельным методом на поверхность агаризованной среды чашек Петри (d = 90 мм) для образования сплошного газона из расчета 100 мкл на чашку. В наносимой на поверхность агаризованной среды суспензии содержание каждого микроорганизма составляло 4,5 McFarland Standard No, что соответствует 9,0×108–1,2×109 КОЕ/мл. Суспензию микроорганизмов тщательно растирали шпателем по всей поверхности агара. Затем каждую чашку с внесенным микроорганизмом подвергали обработке с применением плазменно-дуговой хирургической установки для лечения ран «Плазморан» (ТУ 9444-001-43009282-2015, производства ООО «Плазмопром», Россия) в заданном режиме с учетом расстояния 10, 15 и 20 см (Фактор L) и времени воздействия 15, 30, 45 с для бактерий и 30, 45 и 60 с для грибов (Фактор T). В процессе проведения исследования использовали один режим плазмогенерации, три варианта расстояния от среза сопла плазмотрона до плоскости расположения культуры в чашке Петри, четыре варианта экспозиции действия факторов НТАП на культуры. В качестве установления титра микроорганизмов, используемого для посевов в инокуляте бактериальной взвеси, применяли способ разведения с посевом на чашке Петри с последующим учетом роста КОЕ на поверхности агаризованных сред.

Обработке подлежали секторы посева бактериальных культур, попадающие в область воздействия прибора, которую контролировали по зоне освещенности на питательной среде. В качестве контроля использовали посевы микроорганизмов без обработки НТАП.

После обработки НТАП чашки с культурами помещали в термостат для культивирования. Контрольная группа с посевами микроорганизмов также помещались в термостат для дальнейшего инкубирования.

Оценку эффективности влияния НТАП на задержку роста микроорганизмов определяли по наличию или отсутствию зоны лизиса на питательной среде. Оценку результатов проводили путем замера диаметра задержки зоны лизиса и подсчета в зоне лизиса числа выросших клонов микроорганизмов.

Чашки с посевами инкубировали в инкубаторе «BD240» (Binder, Германия) в течение 24–48 ч при температуре 37 ± 1 °С для бактерий и при двух температурных режимах, 37 ± 1 и 26 ± 1 °С, для грибов. После инкубации проводили подсчет выросших колоний, осуществляемый двумя способами: вручную и с помощью автоматического счетчика колоний Scan 1200 (Франция). Чистоту каждой культуры и идентификацию проводили методом масс-спектрометрии на масс-спектрометре Microflex c программным обеспечением (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Затем биомассу выросших колоний бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, снимали с поверхности двух чашек плотной среды.

Оценку влияния НТАП на выживаемость микроорганизмов из группы ESKAPE-патогенов проводили через 24 ± 2 ч для бактерий и через 48 ± 2 ч и 7 сут для грибов.

Рабочими факторами, формируемыми плазмогенератором, были: газодинамический поток рабочего газа; рекомбинационное излучение с широким спектром — от области вакуумного ультрафиолета до ближнего инфракрасного диапазона; газ аргон с выраженными каталитическими свойствами в реакциях с участием кислорода, азота и их соединений; озон, образующийся в результате воздействия рекомбинационного излучения на кислород воздуха.

При обработке чашек излучением НТАП чашки основной группы располагали так, чтобы пятно освещенности излучения НТАП краевой области охватывало центральную зону посева (рис. 1). В контрольных группах всех исследованных тест-микроорганизмов чашки с культурой не подвергали воздействию излучения НТАП.

При обработке использовали режим прибора В2 при значениях фактора времени (Т) 15, 30, 45 с и фактора расстояния (L) 10, 15, 20 см. Энергетические характеристики, используемые для обработки чашек, указаны в таблице 1. В связи с тем что прибор измеряет энергетическую освещенность (она же интенсивность излучения) в Вт/м2, характер накопления энергии выражается в Дж/м2, который равен Вт/м2 × время излучения (в секундах). Энергетические характеристики излучения НТАП измерены производителем с использованием оборудования «ТКА-ПКМ 13». Прибор имеет три датчика: УФ-А (400–315 нм), УФ-В (315–280 нм), УФ-С (280–200 нм).

Оценку результатов исследования эффективности обработки НТАП проводили на основании подсчета процента отмирания бактерий и грибов на поверхности контрольных и опытных образцов по формуле:

Эффективность (%) = 100 – ( (ΣT × 100)/Сср), (1)

где Сср — среднее значение количества бактерий в исходной суспензии, равное отношению ∑С/N;

∑С — сумма всех колоний, выросших на чашках во всех повторностях;

N — количество повторностей;

Тср — среднее значение количества бактерий, выросших на чашках после 24–48 ч инкубации посевов, равное отношению ∑Т/n;

∑Т — сумма всех колоний, выросших на чашках после 24–48 ч инкубации посевов во всех повторностях;

n — количество чашек (не менее 5 для каждого исследуемого тест-микроорганизма или смеси тест-микроорганизмов в соответствии с ЕН ИСО 11737-11),используемых для исследования (одинаковое для контроля и обработанной НТАП чашки Петри с тест-микроорганизмами).

Критерием антимикробной активности в отношении тест-микроорганизмов или смеси тест-микроорганизмов считали снижение роста колоний не менее чем на 99,99% или полное отсутствие роста тест-микроорганизмов. Определение жизнеспособных колоний проводили путем подсчета выросших колоний каждого вида микроорганизмов на поверхности питательных сред в чашках Петри (с использованием микроскопа биологического Leica DM6B-Z, ин/н-243302670221503917, з/н-503838 со встроенной камерой; увеличение ×100).

Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием пакета программ Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Подсчитывали стандартное отклонение и ошибку после учета результатов на каждой из 5 чашек, применяли t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони, считая распределение нормальным. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Первый этап исследования проводили с музейными культурами в трех повторностях для каждой комбинации, включающей расстояние и время воздействия НТАП.

В результате исследований, проведенных на эталонных музейных культурах при воздействии НТАП (при различном расстоянии и времени обработки), достигнуто угнетение бактериального роста (эффективность 99,999–100%) в отношении E. faecalis АТСС 29212, E. Faecium 9/63, K. pneumoniae subsp. pneumoniae АТСС 700603, E. coli АТСС 10536, P. aeruginosa ATCC 10145, S. Aureus 906; соответствующие данные представлены в таблице 2.

Эффективность угнетения бактериального роста на уровне 100% достигнута для Enterococcus faecalis на расстоянии 10 см через 15 с при воздействии дозы УФ-А 42,15 Дж/м2, дозы УФ-В 17,1 Дж/м2 и дозы УФ-С 39,75 Дж/м2. В то же время угнетение бактериального роста при воздействии доз на уровне УФ-А 84,3 Дж/м2, УФ-В 34,2 Дж/м2 и УФ-С 79,5 Дж/м2 было достигнуто при экспозиции 30 с, а при воздействии УФ-А 126,45 Дж/м2, УФ-В 51,3 Дж/м2 и УФ-С 119,25 Дж/м2 через 45 с; при обработке на расстоянии 15 см угнетение бактериального роста было достигнуто через 45 с при воздействии УФ-А 56,7 Дж/м2, УФ-В 23,85 Дж/м2 и УФ-С 51,3 Дж/м2.

В результате воздействия НТАП в течение 45 с на музейные штаммы Klebsiela pneumoniae subsp.pneumoniae АТСС 700603, E. coli АТСС 10536, Enterococcus faecalis АТСС 29212, Enterococcus faecium 9/63, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 дозой УФ-В 15,9 Дж/м2 и в течение 60 с на Candida albicans 24433 АТСС дозой УФ-В 68,4 Дж/м2 на расстояния 10 см в зоне направленного воздействия НТАП было обнаружено отсутствие роста всех указанных микроорганизмов; соответствующие данные приведены на рисунке 2.

В ходе исследования проводили изучение воздействия НТАП на чашки с посевами микроорганизмов из группы ESKAPE-патогенов: грамположительные бактерии MRSA S. aureus, E. faecalis, E. faecium; грамотрицательные бактерии K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli, а также на дрожжеподобные грибы C. albicans, используя разные расстояние среза сопла плазмотрона до плоскости расположения культуры в чашке Петри и время воздействия; полученные результаты представлены на рисунке 3.

В результате исследований установлено, что с применением переменных параметров (расстояния и времени) при обработке НТАП культур получена эффективность 99,999–100% угнетения бактериального роста (табл. 3).

Исследования воздействия НТАП проводили в 5 повторностях в отношении клинических штаммов микроорганизмов из группы ESKAPE-патогенов K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli, грамположительных бактерий MRSA S. aureus, E. faecalis, E. faecium, обладающих множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам по системе EUCAST, и в 3 повторностях для каждой комбинации воздействия на смесь музейных эталонных культур E. coli АТСС 10536, K. pneumoniae subsp. pneumoniae АТСС 700603, S. aureus 906, P. aeruginosa ATCC 10145, E. faecalis АТСС 29212, E. Faecium 9/63.

При исследовании, проведенном на смеси музейных культур, установлена 99,999% эффективность влияния НТАП при использовании переменных параметров расстояния и времени обработки. Выживаемость наблюдалась в основном штаммов K. pneumoniae subsp. pneumoniae АТСС 700603; жизнеспособных колоний P. aeruginosa ATCC 10145, музейных штаммов E. coli АТСС 10536, S. aureus 906, E. faecalis АТСС 29212, E. Faecium 9/63 не обнаружено (табл. 4).

При оценке эффективности воздействия НТАП на выживаемость смеси клинических штаммов микроорганизмов установлена 99,997–99,999% эффективность влияния НТАП по сравнению с исходным внесенным уровнем микроорганизмов. После воздействия НТАП на чашках после инкубации обнаружены единичные колонии клинических штаммов K. pneumoniae и A. Baumannii, при этом жизнеспособные колонии штаммов P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, E. faecalis, E. faecium, Candida albicans не обнаружены. Результаты исследования представлены в таблице 5.

Антимикробное действие НТАП заключается в гибели бактериальных культур (грамположительных и грамотрицательных потенциально патогенных клинических штаммов микроорганизмов, обладающих множественной антибиотикорезистентностью) и дрожжевых грибов.

Результаты проведенного исследования показали, что в 99,999% гибель микроорганизмов происходит при достижении уже самой минимальной дозы воздействия УФ-А 12,05 Дж/м2, УФ-В 4,68 Дж/м2, УФ-С 10,2 Дж/м2 совокупности факторов НТАП, указанных в таблице 5.

С увеличением значения расстояния действие НТАП становится слабее, а с увеличением значения времени действие НТАП усиливается. Таким образом, комбинация факторов расстояния и времени определяет общую энергию НТАП, передаваемую микроорганизму.

Это подтвердили данные исследований in vitro на культурах микроорганизмов, таких как K. pneumoniae, A. Baumannii, и грибов C. albicans. Воздействие на больших расстояниях (15–20 см) в течение определенных периодов времени (15 с для бактерий и 30 с для грибов) не оказывало никакого эффекта на вышеуказанные выбранные культуры.

Параметры воздействия НТАП, которые приводили к гибели микроорганизмов, зависели от вида микроорганизма, времени и расстояния воздействия. Обнаружена экспоненциальная зависимость количества жизнеспособных бактерий A. baumannii, K. pneumoniae и грибов C. albicans после воздействия НТАП от значения энергетической освещенности за счет расстояния и времени воздействия, при достижении которой происходила гибель бактерий.

Важно отметить, что при воздействии на МRSА S. aureus и Р. Аeruginоsа жизнеспособность микроорганизмов полностью нарушалась, что происходило при всех значениях параметров расстояния и времени.

В результате проведения исследования выживаемости микроорганизмов и их ассоциаций при воздействии НТАП in vitro — эталонных музейных культур E. coli АТСС 10536, K. pneumoniae subsp. pneumoniae АТСС 700603, S. Aureus 906, P. aeruginosa ATCC 10145, E. faecalis АТСС 29212, E. Faecium 9/63, грибов C. albicans АТСС 24433 и штаммов из группы ESKAPE-патогенов K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli, грамположительных бактерий MRSA S. aureus, E. faecalis, E. faecium, обладающих множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам по системе EUCAST, дрожжеподобных грибов C. albicans установлено, что эффективность воздействия факторов НТАП, формируемых плазменно-дуговым оборудованием установки «ПЛАЗМОРАН», обеспечивает снижение титра жизнеспособных микроорганизмов с 108–109 до единичных КОЕ/мл, т.е. на 8–9 порядков, как для музейных штаммов, так и для клинических бактериальных штаммов, и составляет 99,99–100%.

В научной литературе уже признается большой потенциал антибактериального воздействия низкотемпературной плазмы на патогены ESKAPE [31]. В целом полное подавление роста неприкрепленных микроорганизмов из группы ESKAPE при воздействии низкотемпературной плазмы достигается за период от 1 мин до 3 часов в зависимости от устройства, типа разряда, выходного напряжения и других факторов [31]. Наиболее быстрое подавление роста ESKAPE-патогенов было описано в работе Flynn et al. (2015) [32]. При использовании нетермической плазмы атмосферного давления было обнаружено быстрое антибактериальное действие в отношении всех патогенов ESKAPE в неприкрепленной (планктонной) форме роста. Полное уничтожение Enterobacter cloacae достигалось за 45 с, P. aeruginosa — за 60 с, E. faecium, K. pneumoniae и A. baumannii были полностью инактивированы в течение 120 с. S. aureus был наиболее устойчивым, для его инактивации потребовалось 240 с воздействия низкотемпературной плазмы.

В результате проведенной работы получена высокая эффективность применения НТАП в экспериментальных условиях с определением процента гибели жизнеспособных бактериальных и грибковых культур. В настоящем исследовании практически полное уничтожение жизнеспособных клеток тест-культур ESKAPE-патогенов происходило за время экспозиции НТАП, составляющее 15 с при дозе УФ-А 12,15 Дж/м2, УФ-В 4,68 Дж/м2 и УФ-С 10,2 Дж/м2 на расстояния 20 см.

Установлено, что дрожжеподобные грибы C. albicans более устойчивы к факторам воздействия НТАП по сравнению с бактериями, и их уничтожение требует большей экспозиции воздействия и меньшего расстояния от сопла плазмотрона до обрабатываемой поверхности, при этом эффективность воздействия составляет так же, как и для бактерий, от 99,99 до 100%.

Рядом исследований показано, что грибы менее чувствительны к низкотемпературной плазме, чем бактерии [33]. Однако эффективность низкотемпературной плазмы в отношении инактивации грибов зависит от вида гриба, подаваемых газов, расстояния между плазменным устройством и образцом, а также времени обработки [34][35]. В большинстве исследований сообщалось, что нетермическая и низкотемпературная плазма может эффективно инактивировать дрожжевые клетки Candida albicans [34].

Некоторые исследователи подчеркивают, что обработка штаммов низкотемпературной плазмой связана с проблемами безопасности, а именно: микроорганизмы, выжившие после воздействия плазмы, генетически и фенотипически модифицируются, и эти измененные штаммы могут быть опасны для окружающей среды. Так, было показано, что C. albicans, выжившие после обработки плазмой, демонстрировали генетическую изменчивость, но не показывали каких-либо значительных изменений в метаболизме и восприимчивости к лекарственным препаратам [35]. С одной стороны, это свидетельствует о том, что обработка низкотемпературной плазмой связана с небольшой вероятностью образования генетически и фенотипически неблагоприятных штаммов [34][35], а с другой стороны, для решения проблемы безопасности необходимо больше экспериментальных данных. Дальнейшие исследования в этом направлении следует провести по оценке безопасности воздействия НТАП и вклада основных факторов в антибактериальный и пролиферативный эффект для лечения послеоперационных ран на модели in vivo.

1 ГОСТ ISO 11737-1-2012 ««Стерилизация медицинских изделий. Микробиологические методы. Часть 1. Оценка популяции микроорганизмов на продукции».