Разработка и оценка набора реагентов для количественного определения уровня экспрессии мРНК химерного гена BCR::ABL1

ВВЕДЕНИЕ

Хронический миелолейкоз (ХМЛ) представляет собой клональное опухолевое миелопролиферативное новообразование, обусловленное злокачественным перерождением стволовых гемопоэтических клеток и характеризующееся усилением пролиферации гранулоцитарного ростка без потери способности к дифференцировке, гиперплазией миелоидной ткани, миелоидной метаплазией кроветворных органов, ассоциированное с хромосомной аномалией — транслокацией t(9;22)(q34;q11) так называемой филадельфийской хромосомы, в результате которой образуется химерный ген BCR::ABL1 [1]. Данное слияние является наиболее частой цитогенетической аномалией у взрослых пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) — в 95% случаев, а также с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) — в 30% у взрослых и примерно в 5% у детей¹ [1].

По данным статистики за 2022 год в России было выявлено 1087 новых случаев заболевания ХМЛ; среди них 54% случаев у женщин и 47% случаев у мужчин. Указанная нозология чаще всего (в 28,9% случаев) регистрируется у лиц в возрасте 60–69 лет, в 16,5% случаев ХМЛ выявлен у людей в возрастах 50–59 и 70–79 лет, частота встречаемости ХМЛ в возрасте 30–39 лет составляет 12% [2].

Диагностика транслокации осуществляется с помощью цитогенетического исследования (кариотип) костного мозга либо молекулярно-цитогенетического исследования (FISH-метод), а также определением количественного уровня экспрессии мРНК BCR::ABL1 р210 для транскриптов e13a2 или e14a2².

Целью современной терапии является достижение большого молекулярного ответа (БМО > 3,0), глубокого молекулярного ответа (МО ≥ 4,0) и последующего предотвращения появления опухолевых клонов [3][4]. Для мониторинга ответа на лечение ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) используются несколько методов оценки: полный гематологический ответ, определяемый путем исследования полного количества клеток крови, дифференцированный, выполняемый с помощью проточной цитометрии, и полный цитологический ответ, оцениваемый с использованием аспирата костного мозга и образцов биопсии на основании изучения молекулярного ответа с помощью количественной ПЦР [5].

Наиболее чувствительным методом оценки минимальной остаточной болезни является ПЦР, однако в большинстве лабораторий используются наборы реагентов различных производителей, вследствие чего возникает высокая межлабораторная вариабельность полученных результатов, что может привести к несоответствию сравниваемых показателей и повлиять на выбор тактики в лечении пациентов. Согласно рекомендациям Европейской сети по лейкемии и Национальной комплексной онкологической сети (National Comprehensive Cancer Network), с целью гармонизации молекулярного мониторинга ХМЛ необходимо контролировать уровни мРНК BCR::ABL1 с использованием международной шкалы (IS), которая основана на стандартизированном базовом уровне транскрипта, представленном в исследовании Международного рандомизированного исследования интерферона и STI571 (International Randomized Study of Interferon and STI571–IRIS) [3]. По результатам проведенного исследования было предложено оценивать логарифмическое снижение BCR::ABL1 (отношение IS) во время терапии по сравнению с исходным соотношением IRIS при постановке диагноза [6][7]. Для применения данной Международной шкалы каждая лаборатория должна откалибровать полученные результаты, используя коэффициент преобразования (CF), числовое значение которого необходимо умножать на количественные показатели, полученные в конкретной лаборатории. С целью определения коэффициента преобразования, индивидуального для каждой лаборатории, Всемирная организация здравоохранения создала международную генетическую панель для количественной оценки транскриптов BCR::ABL1 с помощью ПЦР, содержащую четыре различных варианта (10, 1, 0,1, 0,01%), c использованием клеточной линии К562, разведенной в клеточной линии, не имеющей слияния BCR::ABL1 [9].

По рекомендациям Международных руководств для диагностики экспрессии мРНК BCR::ABL1 и мониторинга минимальной остаточной болезни необходимо использовать количественный метод ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с чувствительностью обнаружения ниже, чем МО 4,5 (0,0032% IS) [4][9]. Использование реагентов с недостаточной чувствительностью может привести к получению некорректных результатов анализов и, как следствие, к преждевременному прекращению лечения и дальнейшему развитию заболевания [6]. Согласно Клиническим рекомендациям определен порядок периодического мониторинга уровня экспрессии: при уровне экспрессии мРНК р210 BCR::ABL1 ниже БМО количественная ПЦР в реальном времени проводится каждые 3 месяца, по достижении БМО — каждые полгода [10][11]. В этой связи актуальными являются разработка, апробация и внедрение в клинико-лабораторную практику отечественных высокочувствительных специфичных диагностических наборов реагентов для определения уровня транскриптов BCR::ABL1 с помощью ПЦР.

Цель работы — разработка и оценка набора реагентов для количественного определения уровня экспрессии мРНК химерного гена BCR::ABL1 в образцах периферической крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 50 человек в возрасте от 20 до 80 лет, среди них 28 мужчин и 22 женщины. В основную группу были включены 39 пациентов с установленным клиническим диагнозом ХМЛ. Для проверки аналитической специфичности на отсутствие ложноположительных результатов были использованы образцы крови 11 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой пациентов.

Образцы периферической крови были получены в МКНЦ им. Логинова после информационного согласия. Забор крови осуществляли в вакуумные пробирки с К2 ЭДТА (Китай, РУ № РЗН 2013/921 от 25.05.2018). Для подтверждения диагноза ХМЛ и определения уровня экспрессии мРНК химерного гена BCR::ABL1 использовали набор реагентов для выявления и количественного определения мРНК химерного гена bcr-abl (вариант M-bcr) и мРНК гена abl в клиническом материале методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия, РУ ФСР 2007/00579) согласно инструкции производителя.

Выделение РНК осуществлялось с помощью набора реагентов АмплиТест® РИБО-преп (ФГБУ «ЦСП» ФМБА, Россия) согласно инструкции. Эффективность выделения мРНК определяли с помощью флуориметра Qubit 4 (Thermo Scientific, США).

В состав разработанного набора реагентов входят специфичные праймеры и флуоресцентно-меченные зонды, наличие которых позволяет проводить одновременное обнаружение экспрессии химерного гена BCR::ABL1 и гена ABL1. Олигонуклеотиды для выявления экспрессии химерного гена были подобраны на основании рекомендаций международной группы Europe Against Cancer (EAC) 2003 г. и позволили выявлять 2 наиболее часто встречающихся химерных транскрипта: e13a2 (b2a2) и e14a2 (b3a2). Контроль взятия материала, выделение РНК, прохождение реакции обратной транскрипции и ПЦР осуществляли с помощью эндогенного внутреннего контроля, в качестве которого были использованы специфично подобранные праймеры и зонд на ген ABL1.

Концентрации праймеров и флуоресцентно-меченых зондов были подобраны экспериментально.

Реакционную смесь готовили с использованием следующих реагентов (производство ФГБУ «ЦСП» ФМБА, Россия): 5х ПЦР-буфер (5 мкл), 10 mM dNTP (0,5 мкл), Taq-полимераза (0,5 мкл), ревертаза MMLV (0,25 мкл).

Условия ПЦР амплификации: обратная транскрипция при 50 °С (30 мин), предварительный прогрев 95 °С (15 мин), далее 45 циклов: денатурация 95 °С (10 сек) и отжиг 60 °С (60 сек). Детекция флуоресцентного сигнала по каналу FAM и HEX.

Интерпретацию результатов проводили только при правильных результатах для отрицательного контрольного образца (ОКО) и положительного контрольного образца (ПКО) при каждой постановке. В качестве ОКО была использована стерильная деионизованная вода, ПКО представляет собой смесь бактериофаговых препаратов, содержащих последовательности мРНК транслокации p210 химерного гена BCR::ABL1 и мРНК контрольного гена ABL1.

Для установления предела обнаружения специфичности и чувствительности разработанного набора использовалась РНК, выделенная из клеточной линии К562 (BCR::ABL1 — положительная) и HeLa (образцы дикого типа), а также образцы от пациентов с ХМЛ и здоровых доноров. Для определения относительной чувствительности были приготовлены клеточные стандарты с определенными концентрациями 10, 1, 0,1, 0,01% согласно процедуре, описанной White et al., 2010 г [8]. Количество клеток подсчитывали с помощью автоматического счетчика Countess II FL Automated Cell Counter (Thermo FS). Полученные стандарты были калиброваны согласно протоколу WHO [12].

Оценка относительного уровня экспрессии мРНК химерного гена BCR::ABL1 проводилась на основании расчетов в отношении BCR::ABL1/ABL1 по следующей формуле:

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v.4.5.0 (разработчик — ООО «Статтех», Россия). Различия считались значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате апробации разработанного нами набора реагентов были получены следующие результаты. Параметры ПЦР в реальном времени: эффективность в пределах 95–105%, коэффициент корреляции r = 0,99. По данным экспериментальных работ с использованием клеточных стандартов относительная чувствительность разработанного набора составила 0,01%, что соответствует уровню ПМО (полного молекулярного ответа)³. Воспроизводимая чувствительность по контрольным плазмидам и на РНК, выделенной из культуры клеток К562, — 100 копий/мл (CV% = 1,86).

Проверка аналитической специфичности показала отсутствие ложноположительных результатов при тестировании образцов, полученных от здоровых пациентов, при этом определялся только сигнал внутреннего контроля по каналу HEX и отсутствовал сигнал детекции мРНК химерного гена BCR::ABL1 по каналу FAM.

В исследовании была проанализирована случайная выборка образцов периферической крови больных с клиническим диагнозом ХМЛ. В основной группе экспрессия мРНК транслокации p210 химерного гена BCR::ABL1 была выявлена во всех 39 образцах. Количество положительных результатов среди мужчин составляло 21 (53,8%), среди женщин — 18 (46,2%). Частота встречаемости транслокации в возрастной категории 20–29 лет составила 3,2%, в категории от 30 до 49 лет — 12,9% случаев, в возрастной группе 50–59 лет — 9,6%, в возрастах 60–69 и 70–79 лет — 19,3% пациентов, 6,4% случаев встречаемости транслокации зарегистрировано в возрастной категории от 80 лет, что согласуется со статистическими данными.

Наибольшее количество пациентов с отмеченными изменениями регистрировали в возрастных категориях 60–69 и 70–79 лет, что также согласуется со статистическими данными по России [2]. Пациенты моложе 20 лет представлены не были; это связано с небольшой выборкой и заболеваемостью в этом возрасте: около 1% по стране. ХМЛ одинаково распространен как у мужчин, так и у женщин [13][14].

Относительная экспрессия гена BCR::ABL1 (белок p210, варианты b3a2 или b2a2) по результатам тестирования в образцах периферической крови больных с клиническим диагнозом ХМЛ составила от 2,3 до 100%. При этом количество копий гена ABL1 находилось в диапазоне от 2200 до 17 595 440 копий/мл в группе с диагнозом ХМЛ и от 11 675 896 до 18 634 577 копий/мл в группе здоровых.

Согласно Лабораторным рекомендациям по диагностике и лечению хронического миелоидного лейкоза (European LeukemiaNet) минимальное количество референтных генных транскриптов независимо от того, обнаружен BCR::ABL1 или нет, должно быть не менее 10 000 ABL1 для МR 4, 32 000 для МR 4,5, 100 000 для МR 5 в том же объеме кДНК, в котором тестируется образец на BCR::ABL1 [4]. Количество полученных транскриптов референтного гена соответствует международным стандартам, и результаты могут быть включены в клинические отчеты.

Во время тестирования пациентов из группы с клиническим диагнозом ХМЛ было выявлено 8 образцов IS ≤ 1% BCR::ABL1 (МR 2), 9 образцов IS ≤ 0,1% (МR 3), 7 образцов IS ≤ 0,01% (MR 4), 7 образцов IS ≤ 0,0032% (МR 4,5). Объектом исследования были образцы крови рандомных пациентов. Критерием включения в основную группу пациентов было наличие подтвержденного диагноза ХМЛ, установленного с использованием зарегистрированного в России аналога «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT».

Апробация разработанного набора реагентов на образцах периферической крови с известным уровнем экспрессии химерного гена BCR::ABL1 продемонстрировала полное совпадение с результатами, полученными при использовании набора реагентов «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT».

При установлении диагноза ХМЛ для выявления химерного гена BCR::ABL1 применяют молекулярно-генетическое исследование (FISH-метод), а также определение экспрессии мРНК BCR::ABL1 p210 (количественное) для химерных транскриптов e13a2 или e14a2 методом ПЦР [15]. Данный метод также используют при оценке уровня ответа на лечение пациентов с помощью ингибиторов тирозинкиназы (ИТК) и определении уровня минимальной остаточной болезни, когда количество остаточных лейкемических клеток ниже уровня чувствительности цитогенетических исследований [16].

В настоящее время на рынке существует ряд отечественных тест-систем, направленных на выявление мРНК химерного гена BCR::ABL1. Например, «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора), ОНКОСКРИН 1-1-Q (ООО «ГеноТехнология»), имеющие регистрационные удостоверения, так и без регистрационных удостоверений: «Миелоскрин BCR-ABL» («Формула гена»), BCR-ABL1 Mbcr RQ Kit® (ООО «Иноген»).

Аналитическая чувствительность набора «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT» по количеству воспроизводимых копий ниже в 2 раза по сравнению с анализируемым нами набором и составляет 237 копий/мл vs 100 копий/мл⁴. В то же время проведение анализа с использованием набора «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT» предполагает постановку первоначально изолированной реакции обратной транскрипции, а далее проведение ПЦР в реальном времени, что довольно трудозатратно. В отличие от набора сравнения, в разработанном комплекте использовали смесь, позволяющую детектировать экспрессию мРНК BCR::ABL1 p210 в одной пробирке.

Результаты количественной оценки мРНК BCR::ABL1, полученные с использованием тестируемого набора, совпали с результатами, зарегистрированными с помощью набора «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT», во всех образцах. Оба набора могут идентифицировать по крайней мере 4,5-кратное снижение отношения IS.

С помощью набора «BCR/ABL МУЛЬТИТЕСТ» возможно одновременное выявление химерных транскриптов р210, р190 и р230 гена BCR::ABL1 с применением мультиплексного формата ОТ-ПЦР, что экономически целесообразно при проведении первичного скрининга [17].

Н. Kitamura et al. в 2019 г. представили новый высокочувствительный двухэтапный набор реагентов ОТ-ПЦР (Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) с диагностической чувствительностью IS 0,01%, которая была определена с помощью вторичной контрольной панели Armored RNA Quant® (ARQ) (Asuragen, Inc., Остин, Техас, США) [6].

М.В. Дубиной и соавт. были определены аналитические показатели теста, при котором специфичность должна стремиться к 100%, адекватным показателю уровня чувствительности 3–5 копий мРНК на реакцию, при этом отношение транскрипта BCR::ABL1 к гену-нормализатору должно составлять 0,01% (соответствует уровню ПМО) [18].

По сравнению с аналогом разработанный набор имеет ряд преимуществ. Во-первых, у него более высокие аналитические показатели. Во-вторых, использование одностадийной ОТ-ПЦР дает возможность значительно снизить риск контаминации, технических ошибок при раскапывании реагентов и образцов, а также снижает время работы персонала. В-третьих, применяемая мультиплексная смесь специфических зондов и праймеров по двум каналам детекции позволяет существенно сократить объем используемого расходного материала.

Таким образом, нами был создана высокочувствительная мультиплексная тест-система, позволяющая одновременно детектировать транскрипты e13a2 (b2a2) и e14a2 (b3a2) транслокации p210, а также содержащая эндогенный внутренний контроль с оценкой правильности прохождения всех этапов ПЦР, включая выделение РНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количественное определение и обнаружение транслокации при ХМЛ важны для выбора протоколов лечения и мониторинга рецидивов заболевания, а чувствительный и точный мониторинг минимальной остаточной болезни играет важную роль в управлении лечения ХМЛ, облегчая принятие решения о прекращении лечения и выявляя пациентов с риском прогрессирования. Апробирование разработанной тест-системы, позволяющей выявлять транскрипт р210 химерного гена BCR::ABL1, показало достаточно высокий порядок диагностической специфичности и чувствительности разработанного набора реагентов для количественного выявления уровня относительной экспрессии мРНК химерного гена BCR::ABL1 в крови с целью верификации диагноза ХМЛ на уровне 100%. Использование эндогенного внутреннего контроля (ген ABL1) позволило контролировать основные этапы ПЦР-исследования (пробоподготовку, выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и амплификации).