Анализ факторов, влияющих на процессы апоптоза в периоде отдаленных последствий тяжелых острых отравлений нейротропными токсикантами

ВВЕДЕНИЕ

Отдаленный период после тяжелых острых отравлений нейротропными токсикантами характеризуется развитием преимущественно неспецифических проявлений психоорганического синдрома, постинтоксикационной и цереброгенной астенией, токсическими полинейропатиями. Токсическое поражение нервной системы, как и других тканей организма, имеет различные морфологические изменения на клеточном и тканевом уровнях и проявляется в основном дистрофическими и некротическими процессами [1][2]. Применение световой микроскопии позволяет установить наличие апоптоза нейронов, которое является следствием большинства токсических поражений нервной системы [3]. Для токсического повреждения ткани головного мозга наиболее характерны мелкие очаги некроза, часто элективного, при котором повреждаются только отдельные элементы ткани (часть из них сохраняется); такие очаги проявляются разрежением нейропиля и глиопенией. Морфологической основой психоорганического синдрома при нейроинтоксикациях является гибель нейронов и глиальных клеток, связанная как с прямым токсическим действием ксенобиотиков, так и с индукцией процессов апоптоза [4]. Ключевыми механизмами патогенеза постинтоксикационной астении, определяющимися спецификой токсиканта, являются активация апоптоза, нарушение трофики, активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), недостаточность нейропептидного звена регуляции, нарушения ликвородинамики. Токсические нейропатии проявляются сегментарной демиелинизацией (токсической миелинопатией) и аксональной дегенерацией (токсической дистальной аксонопатией).

К неспецифическим механизмам токсического действия, характерным для всех нейротропных ксенобиотиков, могут быть отнесены: угнетение активности ферментов за счет блокады сульфгидрильных, карбоксильных, амино- и других функционально активных структурных групп в составе пептидов и белков; формирование оксидативного стресса с последующей активацией процессов ПОЛ¹; угнетение митохондрий; нарушение гомеостаза кальция; эксайтотоксичность; экспрессия провоспалительных цитокинов, индукция воспалительных процессов в нервной ткани; гаптеновая модификация белков с приобретением ими антигенных свойств с индукцией аутоиммунных механизмов повреждения; угнетение высвобождения нейротрофинов, нейроногенеза и глиогенеза в сочетании с подавлением пролиферации и дифференциации новых нейронов и глиоцитов; усиление проницаемости гематоэнцефалического барьера; усиление процессов апоптоза клеток центральной и периферической нервной системы² [5–8].

В настоящее время актуальным и приоритетным является более углубленное исследование отдаленных последствий тяжелых острых отравлений нейротропными токсикантами.

Цель исследования — количественная оценка вклада процессов апоптоза, оксидативного стресса и нейротрофиновой регуляции в формировании отдаленных последствий тяжелых острых отравлений нейротропными токсикантами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальное исследование выполнено на 53 крысах-самцах аутбредной линии с массой тела на начало исследования 180–220 г, поступивших из НИЦ «Курчатовский институт» — питомник «Рапполово», Ленинградская область.

Моделирование отдаленных последствий проводили путем однократного введения нейротропных токсикантов лабораторным животным в дозе ЛД₅₀. Период формирования отдаленных последствий составлял 30 суток. В качестве токсикантов были использованы:

• фенилкарбамат — обратимый ингибитор ацетилхолинэстеразы, синтезированный в лаборатории синтеза лекарственных препаратов Научно-клинического центра токсикологии имени академика С.Н. Голикова [9];
• метанол (АО «Вектон», Россия) — органический растворитель, реализующий свое токсическое действие за счет повреждения клеточных мембран;
• ацетат свинца (ООО АО «Реахим», Россия) — органическая соль тяжелого металла, подавляющая активность различных ферментов.

Лабораторные животные были распределены на 4 группы:

группа 1 — «Контроль» К (n = 8), проведено внутрижелудочное введение 0,5 мл физиологического раствора;

группа 2 — «Фенилкарбамат» (ФК) (n = 15), проведено внутрибрюшинное введение в виде 0,1% водного раствора в дозе 1,6 мг/кг м.т.;

группа 3 — «Метанол» (М) (n = 15), проведено внутрижелудочное введение в виде 75% водного раствора в дозе 11,5 г/кг м.т.;

группа 4 — «Ацетат свинца» (АС) (n = 15), проведено внутрибрюшинное введение в виде 5% водного раствора в дозе 300 мг/кг м.т.

Выявленные в результате наблюдения признаки токсического действия оценивали в баллах в соответствии со шкалой признаков интоксикации [10]. Еженедельно определяли динамику массы тела животных, потребление ими корма и воды.

Для оценки формирования фазы отдаленных последствий токсического действия на 7, 15, 21 и 28-е сутки проводили нейрофизиологическое тестирование животных в тестах «Открытое поле» («VideoMot 2», TSE, Германия), «Вращающийся стержень» («Rota-Rod Treadmills for rats 7700-7750», Ugo Basile, Италия), «Сила хвата» («Gripstrengthmeter 303500 series, TSE, Германия), «Исследование сенсорных реакций» («Startle Response System», TSE, Германия), «Оценка условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ)» (PACS-30, Columbus Instruments, США).

На 28-й день исследования у выживших животных (n = 32) осуществляли забор образцов крови и тканей головного мозга для последующего исследования.

Определение нейроспецифических белков (нейроспецифическая енолаза NSE, нейротрофический фактор мозга BDNF, основной белок миелина MBP и кальций-связывающий белок S100) в плазме крови животных осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов (Cloud-Clone Corp, США) согласно инструкции производителя. Показатели перекисного окисления липидов (диеновые конъюгаты (ДК), малоновый диальдегид (МДА)); антиоксидантной системы (АОС) (восстановленный глутатион (ВГ), активность глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионпероксидазы (ГП), супероксиддисмутазы (СОД)), а также маркера энергетического обмена (активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ)) определяли в гомогенате ткани мозга, как описано ранее [11].

Оценку активности процессов апоптоза осуществляли путем определения количества TUNEL-позитивных (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) клеток в височной коре крыс. Выбор этого участка коры был обусловлен особенностями ее цитоархитектоники (высокая плотность нейронов, радиальное расхождение корковых колонок, наличие интернейронов 8 типов и проекций от слухового, статокинетического, вкусового и обонятельного анализаторов, таламуса, высокая их чувствительность к гипоксии, частые дисплазии и способность к эпилептогенезу). Подсчет апоптотических TUNEL-клеток проводился на 4–5 срезах исследуемой области головного мозга. Был использован коммерческий набор Elabscience® E-CK-A320 «Набор для изучения апоптоза TUNEL In Situ (Green, FITC), One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit». Изображения срезов головного мозга были получены с помощью микроскопа Nikon Eclipse 80i с цветной камерой Nikon DS-Fi1c при увеличении ×100 для анализа и ×200 для фотоматериалов в разрешении 1280×960 пикселей программой NIS-Elements AR 4.20.00. Подсчет апоптотических TUNEL-клеток проводился на 4–5 срезах исследуемой области головного мозга каждого животного.

Статистическая обработка полученных экспериментальных данных осуществлялась в процессоре электронных таблиц MS EXCEL с использованием пакета прикладных программ «Анализ данных» и специализированной программы статистического анализа Statistica v.10. Применялись методы частотного, дисперсионного, факторного и корреляционного анализов. Достоверность различий между группами оценивали с использованием рангового критерия Уайта, критерия метода точной вероятности Фишера для частотного анализа; F-критерия дисперсионного анализа ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Наблюдение за животными в острый интоксикационный период показало, что признаки токсического действия (по сумме баллов, характеризующих особенности внешнего вида, мышечного тонуса, двигательной активности и реакции на взятие на руки) выявлены на 1–2-е сутки с быстрой нормализацией состояния к 5–7-м суткам у выживших животных (рис. 1).

В клинической картине острой интоксикации фенилкарбаматом преобладали признаки судорог и атаксии, при отравлении метанолом — снижение мышечного тонуса и двигательной активности, нарушения координации движений и позы, снижение чувствительности и рефлексов, при интоксикации ацетатом свинца — энтеропатогенный симптомокомплекс, раздражение брюшины, нарушения двигательной активности и дыхания. При этом для разных токсикантов была характерна разная скорость нарастания и снижения симптомов интоксикации (максимально быстрое и более выраженное проявление интоксикации, интенсивное снижение — для фенилкарбамата, более медленное снижение — для метанола). Для ацетата свинца было характерно более медленное нарастание симптомов отравления, что связано с особенностями его всасывания в организме.

В ходе динамического наблюдения у животных не были выявлены статистически значимые различия между контрольной группой и группами выживших после острой интоксикации животных по таким показателям, как масса тела, потребление корма, сила хвата лап, время удержания на вращающемся стержне, а также по отдельным показателям использованных нейрофизиологических методик (локомоторная активность, эмоциональная лабильность, агрессивность, груминг в тесте открытого поля; локомоторная активность и пребывание в освещенном секторе при проведении теста УРПИ; показатели рефлекторного ответа на резкий звук и характеристики латентностей в тесте Startle Response System), в связи с чем они не были отражены в последующих таблицах и рисунках.

На 30 сут исследования были выявлены признаки нарушений водно-пищевого поведения, воспроизведения УРПИ, координации движений, торможения в полисинаптических рефлекторных цепях, истощения активационных влияний (табл. 1), совокупность которых позволила разделить выживших после отравления животных на подгруппы по уровню сформированности функциональных признаков отдаленных последствий острых отравлений.

Данные таблицы 1 свидетельствуют, что в ранние сроки после острой интоксикации (7 сут) отмечали статистически значимое повышение объема потребления воды у животных, получивших фенилкарбамат и метанол, что необходимо для снижения концентрации токсиканта и ускорения его выведения из организма.

Вместе с тем отмечено снижение поисково-исследовательской активности у крыс-самцов в группе воздействия метанола, 2,8 ± 0,7 ед. против 9,2 ± 1,7 ед. у контрольных животных, что является проявлением прямого токсического действия вещества.

Также было зарегистрировано нарушение воспроизведения выработанных условных рефлексов в тесте УРПИ, постстрессорный эффект у животных из группы фенилкарбамата, 33 ± 13 с против 4 ± 3 с в группе контроля; укорочение длительности реакции на вспышку света, 7 ± 1 мс против 13 ± 3 мс в группе контроля. В ходе работы в группе животных, получавших метанол, отмечали снижение амплитуды реакции в ответ на электрический стимул, 46 ± 15 ед., по сравнению с животными из контрольной группы, 224 ± 46 ед. Указанные признаки соответствуют пролонгированному периоду картины острой интоксикации.

В последующие сроки выраженность подобных изменений в основном нивелировалась. В конечной точке исследований (28-е сутки) у животных из группы ФК сохранялись повышенное потребление воды и нарушения воспроизведения условного рефлекса, отмечавшиеся на ранних сроках после интоксикации.

У животных после воздействия метанола к 21-м суткам после первоначального увеличения потребления воды произошло снижение данного показателя. Наряду с этим отмеченное на ранних сроках увеличение длительности реакции на вспышку света и снижение амплитуды ответа на электрический стимул нивелировалось к концу эксперимента.

В группе животных, выживших после отравления ацетатом свинца, снижение потребления воды отмечали весь период наблюдения с нарастанием показателя к 28-м суткам, также зафиксированы нарушения воспроизведения условных рефлексов, реакций на свет (31 ± 2 мс против 15 ± 2 мс в контроле) и звук, причем более существенные, чем выявленные у крыс при воздействии метанолом. Кроме того, для этих животных оказалось невозможным выполнение теста бега на тредбане, а в тесте открытого поля у животных отмечалась некоторая суетливость, сопровождающаяся повышением поисково-исследовательской активности.

Анализ обнаруженной динамики признаков токсического действия и нейрофизиологических показателей позволил выявить признаки, чувствительные к формированию отдаленных последствий острых отравлений. К ним относятся следующие: нарушение водно-пищевого поведения и его эндокринной регуляции (снижение потребления воды), нарушение воспроизведения условных рефлексов, повышенная чувствительность к стрессу (время пребывания в темной камере в тесте УРПИ), невозможность выполнения теста бега на тредбане на высокой скорости движения ленты, торможение в полисинаптических путях (высокая длительность реакции на свет в тесте TSE Startle Response System) и недостаточность (истощение) активационных влияний (низкая амплитуда реакции на электрический стимул в тесте TSE Startle Response System). В совокупности эти признаки позволили на основе балльной системы оценки получить интегральную количественную величину уровня сформированности отдаленных последствий.

Отмечены отдельные сдвиги в исследуемых показателях метаболизма головного мозга, соответствующие данные представлены в таблице 2.

Анализ данных, представленных в таблице 2, показывает, что на 28-е сутки после отравления (период формирования отдаленных последствий острых отравлений) под влиянием острой интоксикации фенилкарбаматом у выживших животных отмечается умеренное снижение белка S100 на 30% (р ≤ 0,05).

В группе животных с отравлением метанолом отмечено статистически достоверное повышение активности СОД на 90% и Г-6-ФДГ на 37%, а также статистическая тенденция к снижению активности на 27% белка S100 при повышении активности ферментов антиоксидантной защиты (глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы на 20–21%), что может отражать компенсаторные процессы в ткани мозга в постинтоксикационном периоде.

После острой интоксикации ацетатом свинца у выживших животных на 28-е сутки наблюдалась статистическая тенденция к повышению маркера нейронального повреждения NSE на 94% и увеличение в 3 раза концентрации конечных продуктов ПОЛ диеновых конъюгатов при снижении активности глутатионтрансферазы на 10%, что отражает проявления нейротоксичности этого соединения. В то же время отмечается и более выраженное, по сравнению с другими токсикантами, статистически достоверное снижение активности на 46% белка S100 и основного белка миелина на 23%, повышение активности нейротрофического фактора мозга BDNF на 42%, а также умеренное повышение активности Г-6-ФДГ на 18%, что отражает высокую активность компенсаторно-приспособительных биохимических механизмов в этом периоде.

Необходимо отметить, что нейроспецифические белки, определяемые в сыворотке крови через 30 суток после острого отравления, оказались малоинформативными для выявления и оценки выраженности отдаленных последствий интоксикаций. Только для ацетата свинца были обнаружены метаболические признаки повреждения нейронов и, вероятно, повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера. Важным является тот факт, что для ацетата свинца типичным является и активация процессов ПОЛ на фоне снижения активности ферментативного звена антиоксидантной системы. Вероятно, эти данные могут быть соотнесены с известной для тяжелых металлов способностью угнетать ферментативную активность широкого круга ферментов за счет связывания с тиоловыми группами в активном центре.

Микрофотографии срезов височной коры головного мозга крыс для оценки влияния токсикантов на процессы апоптоза нейронов представлены на рисунке 2.

При практически одинаковом количестве окрашенных синим ядерных нейронов на срезе коры головного мозга (фотографии слева) под влиянием токсикантов у выживших животных существенно повышается количество апоптотических TUNEL-позитивных нервных клеток — зеленое свечение, правый ряд фотографий (рис. 2).

Результаты оценки активности процессов апоптоза представлены на рисунке 3.

Границами диапазонов (рис. 4) являются: низкого уровня — 6 и менее TUNEL-позитивных клеток на срезе, среднего уровня — 7–10 клеток, повышенного — 14–18 клеток, высокого уровня — 19 и более клеток на срезе.

В анализируемых экспериментальных группах была выявлена следующая структура уровней активации апоптоза (табл. 3).

Данные, представленные в таблице 3, показывают, что фенилкарбамат является сильным индуктором апоптоза, вызывая преимущественно высокий уровень его активации, в то время как метанол и ацетат свинца вызывают умеренную по степени выраженности активацию программированной клеточной гибели нейронов.

После анализа роли отдельных компонентов метаболических систем мозга в активации процессов апоптоза под действием нейротоксикантов установлено, что исследованные в работе показатели метаболизма не играют существенной роли в процессе апоптоза клеток головного мозга на этапе формирования отдаленных последствий тяжелых острых отравлений нейротропными токсикантами, их коэффициенты детерминации находились в диапазоне от 0,02 до 0,11 и не были статистически значимыми. Для нейроспецифических белков, вероятно, это может быть связано как с особенностями токсического повреждения мозга на тканевом уровне, так и со сроками, прошедшими после острой интоксикации, запустившей активацию апоптоза. Так, известно, что NSE достигает максимума в ликворе через сутки после ишемического или геморрагического инсульта, снижается к 4–5 сут и более специфична фокальным повреждениям мозга, чем диффузным [12–15]. Для белка S100 также существуют типичные сроки повышения его концентрации — 2–7 сут. MBP является маркером аксональных повреждений и демиелинизации, которые к сроку 30 сут от момента острой интоксикации могут еще не сформироваться. BDNF в большей степени гиперэкспрессируется при недостатке нейрональной пластичности, клинически более значимой является слабая реакция этого нейротрофина на повреждение мозговой ткани [17][18].

В группе интактных животных уровень апоптоза не имел значимых корреляционных связей ни с нейроспецифическими белками, ни с показателями ПОЛ и антиоксидантной системы (АОС) и представлял собой спонтанно протекающий процесс. В группе животных, перенесших интоксикацию фенилкарбаматом, на уровень апоптоза оказывал умеренное влияние низкий уровень восстановленного глутатиона (r = –0,53). После интоксикации метанолом выявлена слабая корреляционная связь апоптоза и содержания основного белка миелина (r = +0,47), вероятнее всего, отражающая наличие общего для них индуцирующего фактора. После интоксикации ацетатом свинца активность процессов апоптоза нейронов была связана с низкой активностью глутатионтрансферазы (r = –0,66) и СОД (r = –0,47). Следовательно, применение активаторов этих ферментов может быть полезно в комплексе средств профилактики отдаленных последствий отравлений органическими производными свинца.

NSE в группе интактных животных демонстрировала умеренные отрицательные связи с активностью глутатион-зависимых ферментов АОС: ГТ (r = –0,63) и ГП (r = –0,57), т.е. повышение содержания этого маркерного белка может отражать слабость ферментативного звена АОС. В то же время была выявлена положительная корреляционная связь с уровнем восстановленного глутатиона (r = +0,75). В совокупности эти связи могут означать, что повреждение тел нейронов может быть обусловлено нарушением способности утилизировать восстановленный глутатион в реакциях антиоксидантной защиты, так как при этом происходит одновременное повышение его уровня и снижение активности ферментов утилизации. Эта закономерность прослеживается и при отравлении фенилкарбаматом, однако при этом дополнительно отмечается снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (r = –0,67) и положительная корреляционная связь с белком S100 (r = +0,70). После интоксикации метанолом также отмечается накопление неутилизированного восстановленного глутатиона (r = +0,55), но при этом оно сочетается с более низкими значениями BDNF (r = –0,50).

Своеобразная картина взаимосвязей NSE отмечается после интоксикации ацетатом свинца. Выявлена альтернативная активация экспрессии или NSE, или белка S100 (коэффициент корреляции между ними r = –0,81). Причем низкая активность АОС смещает систему в сторону повышения уровня белка S100. При интоксикации свинцом обнаружена выраженная положительная корреляционная связь (практически линейная) между уровнем NSE и активностью СОД (r = +0,94), что подразумевает единую ответную реакцию на отравление свинцом. После отравления фенилкарбаматом этот маркер отрицательно коррелирует с активностью глутатион-зависимых ферментов АОС. При отравлении метанолом повышение количества этого белка в тканях мозга связано с накоплением МДА (r = +0,61) и компенсаторным субстратным повышением активности СОД (r = +0,57). Аналогичная корреляционная связь МВР с СОД была выявлена и после отравления ацетатом свинца (r = +0,53).

При отравлении фенилкарбаматом уровень BDNF коррелировал с диеновыми конъюгатами (r = +0,61), а после отравления метанолом — с дефицитом восстановленного глутатиона (r = –0,60). После отравления свинцом фиксируются нейропротекторные эффекты BDNF: снижение аксональных повреждений по маркеру белка S100 (r = –0,66) и улучшение показателей антиоксидантной защиты (снижение диеновых конъюгатов (r = –0,62), повышение активности глутатионтрансферазы (r = +0,68), глутатионпероксидазы (r = +0,61) и СОД (r = +0,49)).

Белок S100 в группе интактных животных и при отравлении метанолом имеет умеренную корреляционную связь с СОД (r = +0,62). После отравления фенилкарбаматом он коррелирует с уровнем NSE (r = +0,70), что может отражать процесс параллельного повреждения как тел нейронов, так и аксонов. После отравления ацетатом свинца уровень белка S100 повышается при недостаточности антиоксидантной системы — низком уровне восстановленного глутатиона (r = –0,51), ГТ (r = –0,61) и особенно ГП (r = –0,84) и СОД (r = –0,75).

В блоке показателей ПОЛ и АОС в тканях мозга интактных животных выделяется плотный кластер из положительно коррелирующих друг с другом показателей активности глутатион-зависимых ферментов (ГТ и ГП) и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (коэффициенты корреляции в диапазоне от +0,70 до +0,98). При отравлении фенилкарбаматом и метанолом к этому кластеру присоединяется СОД, плотность корреляционных связей снижается незначительно. В то же время после отравления ацетатом свинца этот кластер распадается, ключевым антиоксидантным ферментом становится глутатионпероксидаза, а СОД оказывается соединен умеренной корреляционной связью с глюкозо-6-фосфат дегидрогеназой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показало, что общим для анализируемых токсикантов было повышение количества нейронов, гибнущих путем апоптоза (наиболее выражено при интоксикации фенилкарбаматом), и снижение концентрации белка S100 в сыворотке крови (наиболее выражено при отравлении ацетатом свинца). Специфичной для отдаленных последствий отравления метанолом была умеренная активация ферментов антиоксидантной защиты; возможно, как компенсаторная реакция на активацию процессов ПОЛ. Специфичными для отдаленных последствий отравления ацетатом свинца у выживших животных были повышение концентрации в сыворотке крови NSE и BDNF, снижение белка S100 и МВР, повышение уровня диеновых конъюгатов при снижении активности ГТ, умеренная активация глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы — ключевого фермента пентозофосфатного пути образования в тканях мозга восстановленных форм коферментов окисления субстратов энергетического обмена.

Установлено, что фенилкарбамат проявляет свойства сильного индуктора апоптоза клеток коры головного мозга, метанол и ацетат свинца являются индукторами с умеренной активностью.

Необходимо отметить, что рассчитанные коэффициенты детерминации имеют низкие или умеренные (для глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы) значения. Это позволяет утверждать, что нейроспецифические белки, процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты не оказывают существенного влияния на процессы апоптоза нейронов у выживших животных на этапе формирования отдаленных последствий тяжелых острых отравлений. В связи с этим целесообразно будет продолжить изучение влияния метаболических процессов в ткани головного мозга животных на активность процессов апоптоза и формирование отдаленных последствий на более ранних сроках после острой интоксикации нейротропными токсикантами.