Люминесцентная иммунохроматография на основе комплексных соединений Eu³⁺ для выявления патогенных микроорганизмов и бактериальных токсинов

ВВЕДЕНИЕ

Иммунохроматографический анализ в различных его вариантах широко распространен для проведения экспресс-анализов в клинической лабораторной диагностике при контроле пищевых продуктов, мониторинге объектов окружающей среды для выявления патогенных микроорганизмов и токсинов.

Люминесцентный иммунохроматографический анализ (ЛИХА) является распространенным методом экспресс-диагностики (например, специфических антител к вирусу ящура в сыворотке крови [1]), в котором люминесцентные частицы используются для маркировки антител. Концентрация кардиомаркеров в крови методом люминесцентного иммунохроматографического анализа количественно определяется путем анализа интенсивности люминесценции тест-полоски [2][3]. Преимуществами этого метода являются высокая воспроизводимость результатов, чувствительность, помехозащищенность со стороны естественной флуоресценции исследуемой пробы. ЛИХА широко используется в области безопасности пищевых продуктов [4][5] и мониторинга окружающей среды [6].

Прирост чувствительности, достигнутый в ЛИХА, по сравнению с традиционными метками иммунохроматографии — наночастицами коллоидного золота (НКЗ) — составляет один-два порядка [7][8]. Сравнение флуоресцентных маркеров с метками на основе НКЗ и магнитных наночастиц в ИХА резюмируется в обзоре [9]. Среди люминесцентных маркеров, применяемых в ЛИХА, своими свойствами выделяются полимерные микросферы диаметром 0,1–0,3 мкм, поверхность которых содержит карбоксильные группы, что позволяет осуществлять ковалентную связь с рецепторными белками, например иммуноглобулинами различных классов. При получении микросфер в процессе полимеризации в состав реакционной массы вводят органические комплексы трехвалентного европия, например Eu(DBM)₃Phen, (1,10-фенантролин)-три-(дибензоилметанат) европия; Eu(TTA)₃Phen, (2,9-диметил-4,7-дифенил-1,10-фенантролин-три-теноилтрифторацетонат) европия в количестве не более 10% по массе [10]. Препараты таких микросфер поглощают свет в ближней ультрафиолетовой области при λ_max = 365 нм и флуоресцируют в красной области спектра при λ_max = 615 нм, обладая при этом узким эмиссионным пиком флуоресценции. Для регистрации люминесценции аналитической и контрольной зон иммунохроматограмм (АЗ, КЗ) используют полупроводниковые диоды, фотоэлектронные умножители, видеокамеры. Видеоцифровой метод регистрации (ВЦР) результатов ИХА с различными метками имеет ряд преимуществ по сравнению с другими конструктивными решениями. ВЦР тестов на основе НКЗ, например, позволяет получить количественные данные о содержании токсинов в молочных продуктах [11].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения конъюгатов использовали: моноклональные антитела (МКА) к В-субъединице холерного токсина (ХТ), клон 3D11 (ООО «Хайтест», Россия); МКА к капсульному F1 антигену возбудителя чумы; МКА к спорам возбудителя сибирской язвы, клон SA26; МКА к SEB, клон S222 (ОАО «ВНЦМДЛ», Россия); мышиные поликлональные иммуноглобулины к ККГЛ (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России). Для создания ЛИХТ и тестов на основе НКЗ использовали одни и те же партии и лоты препаратов антител.

В качестве анализируемых антигенов применяли паспортизованные препараты ХТ и SEB, инактивированные микробные клетки Y. рestis, штамм EV, инактивированные клетки B. anthracis, штамм 942 (ФБУН «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора), паспортизованные cахарозо-ацетоновые антигены вируса ККГЛ, штамм 741, генотип Европа 1 (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).

Синтез конъюгатов антител с люминесцирующими микросферами осуществляли путем ковалентного связывания [12]. К 5 мкл суспензии люминесцирующих микросфер (1%, вес/объем) диспергировали в 1,0 мл MES-буфера (0,05 М, pH 6,0) и дополняли 10 мкл растворами EDC и NHS (0,5 мг/мл) для активации карбоксильных групп, содержащихся на их поверхности. Перемешивали и встряхивали на лабораторном вихревом встряхивателе Vortex-3000 (производитель Viggens, КНР) в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте, затем центрифугировали на центрифуге Thermo Scientific SL 4R Plus (производитель Thermo Fisher Scientific, США) при ×9600 g в течение 15 мин, супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 1,0 мл фосфатного буфера (0,01 М, рН 7,4). Затем добавляли 100 мкл раствора антител в концентрации 0,2 мг/мл. Полученную смесь антител и активированных люминесцирующих микросфер постоянно перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. Затем добавляли 100 мкл блокирующего раствора (20% БСА), чтобы заблокировать сайты неспецифического связывания на поверхности люминесцирующих микросфер, и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию центрифугировали при 8000 g в течение 15 мин, супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 200 мкл диспергирующего раствора, препятствующего агглютинации конъюгатов люминесцирующих микросфер с антителами между собой (0,02 М, TRIS-HCl), содержащего 0,5% (вес/объем) трегалозы, 10% (вес/объем) сахарозы, 0,5% поливинилпирролидона, 0,1% Tetronic 1307 (S9), 0,05% ProClin^TM 300, 1% БСА и 0,1% Tween-20), и хранили при 4 °С до применения.

В качестве антител для формирования аналитической зоны ЛИХТ использовали: кроличьи поликлональные антитела к В-субъединице холерного токсина; МКА к капсульному F1 антигену возбудителя чумы, клон F41F8C9; МКА к спорам сибирской язвы, клон 278H4A7 (филиал ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, г. Киров); мышиные иммуноглобулины к антигенам ККГЛ (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России); МКА к SEB S643 (производство ОАО «ВНЦМДЛ») в концентрации 2,0 мг/мл. Антителами контрольной зоны ЛИХТ служили козьи антитела к иммуноглобулинам мыши и козьи антитела к иммуноглобулинам кролика (ООО «Хайтест») в концентрации 0,1 мг/мл.

Для изготовления мультимембранного композита ЛИХТ использовали стекловолоконную мембрану GFCP001000 и целлюлозные мембраны CFSP203000 и CFSP173000 (Millipore), карточки с нитроцеллюлозной мембраной TYPE-CNPF-SN12-L2-P25, 10 µ Mdi (Индия). Готовые тест-полоски помещали в пластиковые оправы TYPE-Device-1 Mdi (Индия), верхнюю крышку которых покрывали матовой черной краской. Перед нанесением на стекловолоконную мембрану конъюгат микросфер с антителами обрабатывали ультразвуком на диспергаторе Labsonic 2000 (производство B. Braun, Германия) в течение 10 с, перемешивали, добавляли буфер хранения до концентрации 0,01%. Полученный конъюгат вручную наносили на стекловолоконную мембрану GFCP001000 Millipore и сушили при комнатной температуре.

В измерительном блоке находится люминесцентный источник света, состоящий из двух ртутных газоразрядных ламп мощностью по 4 Вт каждая. Колбы ламп изготовлены из стекла Вуда, создающего поле равномерного ультрафиолетового облучения иммунохроматограмм с максимумом длины волны при 365 нм, а также источник питания ламп. В корпусе измерительного блока также расположена твердотельная видеокамера с разрешением 1200×1600 пикселей и скоростью съемки видео 15 кадров/с. Перед объективом камеры установлен стеклянный светофильтр эмиссии люминесценции СВ580, обеспечивающий 90% пропускания излучения в диапазоне длин волн от 600 до 900 нм. Видеокамера соединена с компьютером через разъем USB 2.0. Пластиковые оправы, содержащие мембраны ЛИХТ, помещаются внутрь прибора с помощью держателя. Прибор позволяет проводить одновременную регистрацию до 5 иммунохроматограмм, однако предусмотрена возможность измерения и единичных тестов.

Полученные с помощью видеокамеры прибора изображения обрабатывались программой анализа флуоресцентных иммунохроматограмм, работающей в среде Windows 7, 10.

Прибор обеспечивает вычисление интегральной интенсивности аналитической и контрольной зон ЛИХТ с автоматической коррекцией базовой линии. Критерием положительного результата анализа при ВЦР являлось превышение величины интенсивности люминесценции аналитической зоны теста над средним значением фона в «холостом» опыте с учетом ошибки измерения при 95% доверительной вероятности:

[Х_ср. – t_s × SE]_{сигнала} ≥ [Х_ср. + t_s × SE]_фона, (1)

где:

X_ср. — среднее из n измерений;

t_s — коэффициент распределения Стьюдента для n измерений;

Линейная регрессия зависимости интенсивности люминесценции микросфер на мембране от концентрации микросфер построена методом наименьших квадратов с помощью программы Origine 6.1 (OriginLab Corp). Коэффициент корреляции линейной зависимости R = 0,99.

Люминесцентные тесты для иммунохроматографического выявления патогенных микроорганизмов и токсинов были разработаны в «сэндвич»-формате. Подробное описание иммунохроматографических тестов на основе НКЗ в «сэндвич»-варианте и процедуры анализа для выявления бактериальных токсинов и споровых форм микроорганизмов даны в работах [13][14].

В ходе исследования жидкую пробу, потенциально содержащую патогенные микроорганизмы или токсины, вносили на подложку для нанесения образца. Под действием капиллярных сил происходит перемещение жидкости по мультимембранному композиту. Сначала солюбилизируется конъюгат микросфер с иммобилизованными на поверхности специфическими иммуноглобулинами. Конъюгат микросфер люминесцировал в красной области спектра. При этом в случае наличия определяемого антигена в пробе образовывался антигенный иммунный комплекс, который с током жидкости перемещался по аналитической мембране вместе с избытком конъюгата. Далее иммунный комплекс захватывался на аналитической мембране специфическими антителами в АЗ, образуя «сэндвич», а несвязанные антитела конъюгата — антителами, расположенными в КЗ тест-полоски, что приводило к образованию двух люминесцирующих линий. В случае отсутствия антигена в пробе антигенный иммунный комплекс не образуется, поэтому единственная видимая при ультрафиолетовом освещении линия формируется за счет связывания антител конъюгата и антител КЗ (антивидовых по отношению к антителам конъюгата) только в КЗ. Внешний вид тестов для обнаружения клеток вакцинного штамма возбудителя чумы на основе НКЗ и на основе люминесцентных микросфер при ультрафиолетовом облучении с длиной волны 365 нм представлен на рисунке 3.

В таблице 2 приведены пороги обнаружения для различных патогенных микроорганизмов и бактериальных токсинов, достигнутые с помощью ЛИХТ и иммунохроматографии с применением НКЗ.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают на примере микроорганизмов различных таксономических групп (вегетативные и споровые формы бактерий, вирусы, а также бактериальные токсины), что применение иммунохроматографии с конъюгатами на основе микросфер с люминесцентной меткой соединений европия обеспечивает намного большую чувствительность, чем использование тестов с конъюгатами НКЗ. Корректность сравнения обеспечивается использованием тех же партий антител для изготовления тестов на основе люминесцентных антител и тестов на основе НКЗ. При сравнении чувствительности применяли идентичные антигенные препараты.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Применение видеоцифровой регистрации иммунохроматограмм в сочетании с микросферами, содержащими комплексы европия, дает значительный выигрыш чувствительности в ИХА. Это обусловлено значительным объемом микросфер, содержащих большое количество комплексов европия на частицу, и фотофизическими свойствами самих комплексов европия. Эти соединения возбуждаются УФ-светом ближнего диапазона 365–370 нм, а излучают люминесценцию в красной области.

Согласно паспортным данным препарата поверхность одной микросферы содержит до 353 тыс. карбоксильных групп при среднем диаметре микросфер 190 нм. Это позволяет проводить эффективную конъюгацию люминесцирующих микросфер с белками антител за счет образования ковалентных связей между аминогруппами антител и карбоксильными группами микросфер. Конъюгат микросфер с иммуноглобулинами обладает значительным количеством валентностей антител, что способствует эффективному образованию иммунных комплексов с антигенами бактерий, токсинов, вирусов [16].

Применение видеокамер в качестве приемника излучения также является значительным достоинством ВЦР [17], поскольку последние имеют высокую чувствительность и возможность изменять яркость, контраст, гамму изображения. Эти свойства видеокамер позволяют улучшать изображение иммунохроматограмм в широком диапазоне интенсивности люминесценции. Кроме того, ВЦР не требует механических приводов (актуаторов) для перемещения иммунохроматограмм под лучом возбуждающего света.

Нами получены данные относительно существенных различий в чувствительности ЛИХТ и иммунохроматографических тестов на основе НКЗ при выявлении токсинов и патогенных микроорганизмов. Повышение чувствительности обнаружения микроорганизмов и токсинов при применении люминесцентных меток по сравнению с тестами на основе НКЗ объясняется в первую очередь более высокой чувствительностью обнаружения люминесцентных меток по сравнению с чувствительностью обнаружения колориметрических меток (НКЗ). Важным фактором повышения чувствительности является большее количество захватывающих антител в иммунохроматографических конъюгатах люминесцентных микросфер сравнительно с аналогичными конъюгатами НКЗ. Это обусловлено геометрическими размерами микрочастиц: средний диаметр НКЗ составляет 30 нм, а средний диаметр люминесцентных микросфер 190 нм. Указанные факторы приводят к более эффективному процессу иммунохроматографии и детекции результатов анализа. При этом следует отметить, что подготовка проб к анализу, процедура ИХА и время его проведения не изменяются. Технологически изготовление ЛИХТ и тестов ИХА на основе НКЗ также сходны, за исключением стадии синтеза конъюгата, и не требуют изменения технологической линейки производственного оборудования.

Высокая чувствительность ЛИХТ имеет значение для санитарно-гигиенического аспекта применения иммунохроматографии в целом, т.к. дает возможность обнаруживать меньшие концентрации патогенных микроорганизмов и токсинов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах, биологических жидкостях организма. ЛИХТ могут быть полезны для иммунохимической верификации посевов микроорганизмов традиционным микробиологическим методом за счет сокращения времени культивирования, позволяя идентифицировать клетки и бактериальные токсины за более короткое время.

ВЫВОДЫ