Субпопуляции моноцитов и натуральных киллеров периферической крови человека в отдаленном периоде хронического облучения

ВВЕДЕНИЕ

Повышенный риск возникновения злокачественных новообразований (ЗНО) среди жителей побережья реки Течи, пострадавших от воздействия ионизирующего излучения (ИИ), — научно установленный факт, подтвержденный эпидемиологическими исследованиями [1][2]. В работах многих авторов была выявлена корреляционная зависимость между дозой ИИ и риском развития гипертонической болезни, ишемической болезни сердца, цереброваскулярных заболеваний у облученных людей в отдаленные сроки после воздействия ИИ [3]. Однако до сих пор недостаточно изучен механизм влияния ИИ на ключевые иммунные реакции, опосредующие неопластические процессы и/или развитие сердечно-сосудистой патологии у облученных людей в отдаленные сроки воздействия ИИ [4].

Рядом авторов подчеркивается, что у людей, пострадавших в результате техногенного радиоактивного загрязнения реки Течи, по сравнению с необлученными лицами отмечались более низкие показатели интенсивности внутриклеточного кислород-зависимого метаболизма моноцитов, снижение содержания интерлейкина-4 (ИЛ-4), повышение уровней фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) и гамма-интерферона (ИФН-γ) в сыворотке крови [5]. В то же время для ФНО-α установлена слабая взаимосвязь с величиной поглощенной дозы облучения красного костного мозга (ККМ) [6].

При изучении патогенеза отдаленных эффектов хронического облучения моноциты/макрофаги представляют особый интерес. Роль этих клеток в регуляции гемопоэза и регенерации ККМ мало изучена и является перспективным направлением исследований [7] как в физиологических условиях, так и при поражении ККМ остеотропными радионуклидами. Моноциты и макрофаги вносят существенный вклад в развитие реакций как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа, распознавая широкий спектр антигенных субстанций, участвуя в презентации антигена Т-лимфоцитам и регуляции иммунных ответов в зависимости от типа реакции, ее интенсивности и продолжительности, а также участвуют в формировании иммунологической памяти [8].

Для многих видов онкопатологии отмечено, что развитие воспалительного процесса, обусловленного в том числе активными моноцитами/макрофагами, потенцирует превращение предмалигнантной ткани в полностью злокачественную. Ранее отмечалось, что в патогенезе ЗНО иммунные клетки играют двойственную роль. С одной стороны, они способны эффективно и быстро распознавать, обезвреживать и элиминировать из организма стареющие, поврежденные, трансформированные и опухолевые клетки. С другой — иммуноциты, в норме обеспечивающие воспаление и удаление из организма генетически чужеродных агентов, способствуют формированию проопухолевого микроокружения, продуцируя цитокины и ростовые факторы, которые стимулируют развитие опухоли. В частности, производимый макрофагами фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), подавляет в клетках экспрессию гена P53, одного из ключевых регуляторов клеточного цикла и апоптоза, что приводит к недостаточно эффективному ответу на повреждение ДНК, увеличению продолжительности жизни клеток и, как следствие, накоплению мутаций.

Моноциты/макрофаги продуцируют спектр ростовых факторов (в частности, сосудистый эндотелиальный фактор роста — VEGF), что способствует васкуляризации опухоли и ее метастазированию. В свою очередь, сигнальные молекулы опухоли обеспечивают хемотаксис моноцитов из периферической крови в очаг злокачественного роста и их дифференцировку в макрофаги. Сочетание гипоксии и медиаторов, выделяемых опухолевыми клетками, инициирует перепрограммирование de novo рекрутированных макрофагов микроокружения в промоутеры роста опухоли — «опухоль-ассоциированные макрофаги» [9]. Наличие в микроокружении опухоли макрофагов, тучных клеток, нейтрофилов, как правило, ассоциируется с повышенным ангиогенезом и плохим прогнозом. Однако некоторые кластеры макрофагов в микроокружении опухоли могут быть связаны с ее регрессией [10].

Цитолитическая активность натуральных киллеров (НК) определяется балансом между активирующими и подавляющими сигналами и реализуется путем перфорации мембраны клетки-мишени. НK-клетки могут экспрессировать на мембране α-цепь CD8, но в более низкой плотности, чем цитотоксические Т-клетки. Субпопуляции НК человека, экспрессирующие αα-гомодимер CD8, обладают большей цитотоксичностью, чем НK-клетки без молекулы CD8 на мембране. Сообщается, что CD38⁺CD8⁺ НК-клетки обладают высокой цитолитической активностью [11].

Полноценная активация иммуноцитов в ответ на опухолевые антигены может приводить к элиминации опухолевых клеток, тогда как неэффективные иммунные ответы на фоне хронического, ассоциированного с возрастом воспаления [12] способны привести к опухолевой прогрессии. Хронически активированные клетки врожденного иммунитета (моноциты/макрофаги, натуральные киллеры, нейтрофилы и другие) могут способствовать развитию ЗНО посредством подавления иммунных реакций, гиперпродукции активных форм кислорода, повреждающих биологические мембраны и ДНК клеток, секреции ростовых факторов и иными способами. На основании вышеизложенного изучение особенностей количественного состава субпопуляций моноцитов у облученных людей, жителей побережья реки Течи, которые в настоящее время достигли возраста реализации онкогенных эффектов, сопряженных с воздействием ИИ, является актуальным и приоритетным.

Цель работы — оценка абсолютного и относительного количества клеток в субпопуляциях моноцитов и натуральных киллеров в периферической крови у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в отдаленные сроки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование было выполнено на базе Уральского научно-практического центра радиационной медицины ФМБА России. Обследовано 45 хронически облученных сельских жителей, постоянно проживающих в прибрежных районах реки Течи, техногенно загрязненных в 1950-е годы вследствие деятельности производственного объединения «Маяк». Для каждого пациента предварительно были рассчитаны индивидуализированные дозы при помощи системы Techa River Dosimetry System-2016 (TRDS-2016) [13].

33 человека, у которых поглощенная доза, рассчитанная на ККМ, на момент обследования составляла 70 мГр и более, были включены в основную группу. Минимальная доза облучения, рассчитанная на ККМ, у людей из этой группы была равна 88,5 мГр, максимальная — 1429 мГр, диапазон доз, рассчитанных на тимус и периферические лимфоидные органы (ТиПЛО), составил от 12 до 460 мГр. Для детального исследования зависимости «доза–эффект» основная группа была разделена на три подгруппы в зависимости от величины накопленной дозы облучения, рассчитанной на ККМ: 1-я подгруппа — 11 человек с дозами от 70 до 249 мГр; 2-я подгруппа — 10 человек с дозами от 250 до 699 мГр; 3-я подгруппа — 12 человек с дозами от 700 до 1429 мГр.

Группу сравнения составили 10 человек, не имеющих факта техногенного воздействия ИИ в анамнезе, с поглощенной дозой облучения, рассчитанной на ККМ, менее 70 мГр. Доза облучения, рассчитанная на ККМ, у включенных в группу сравнения лиц находилась в диапазоне от 4 до 55 мГр, а доза на ТиПЛО — от 1 до 20 мГр.

Средний возраст обследованных лиц в группе сравнения был равен 71,8 ± 1,2 года, в основной группе — 74,9 ± 0,6 года. Исследуемые группы людей статистически значимо не различались по этническому и половому составу, но отличались по возрасту (p = 0,026). Данные о величине средней дозы облучения на ККМ, ТиПЛО, половом и этническом составе в обследованных группах лиц представлены в таблице 1.

Критериями исключения испытуемых из исследования являлись: признаки острых воспалительных заболеваний, хронических заболеваний в стадии обострения, почечной или печеночной недостаточности, симптомы острого нарушения мозгового кровообращения или черепно-мозговых травм в течение трех месяцев до исследования; подтвержденные онкологические и аутоиммунные заболевания; курсы гормоно-, антибиотико-, химио- и (или) радиотерапии; медицинские процедуры с применением ионизирующих излучений в течение шести месяцев перед исследованием.

Материалом для иммунологического исследования служила периферическая кровь человека. Образцы периферической крови (3 мл) получали из локтевой вены утром натощак в вакуумную пробирку с наполнителем K3-EDTA. Оценку субпопуляционного состава моноцитов и натуральных киллеров в периферической крови проводили на проточном цитометре «LongCyte C3111» (Chenglang Biotechnology, КНР) после предварительной окраски моноклональными антителами, меченными флюорохромами: СD14-PE, СD16-PerCP, СD45-APC (Elabscience, КНР) — панель для анализа моноцитов, СD3-FITC, СD56-РЕ, СD16-PerCP, CD8-PC7, СD45-APC (Elabscience, КНР), CD38-PO (Exbio, Чешская Республика) — панель для анализа НК, с последующим лизированием эритроцитов раствором «VersaLyse» (Beckman Coulter Inc., США) согласно инструкции производителей реагентов по стандартизованной методике [14]. В день взятия крови для исследования иммунологических показателей в клинико-диагностической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России пациентам выполнялся в установленном порядке общий анализ крови с подсчетом лейкоформулы [15].

Статистическую обработку данных проводили в программном пакете «Statistica 12» (демонстрационная версия). Проверка данных на нормальность распределения проводилась при помощи критерия согласия типа Колмогорова — Смирнова. Для описания нормально распределенных данных использовалось среднее арифметическое (М), минимальные и максимальные значения. Для данных, которые статистически значимо отличались от нормального распределения, приводились значения медианы, а также 25- и 75-процентильные значения.

При сравнении массивов параметрических данных применялся t-критерий Стьюдента, а для непараметрических данных использовался U-критерий Манна — Уитни. Качественные данные сравнивались с помощью критерия χ². Статистически значимыми различия считались при уровне доверительной вероятности (р) менее 0,05. Для корреляционного анализа анормально распределенных данных был рассчитан коэффициент ранговой корреляции Спирмена с уровнем доверительной вероятности 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При сравнении значений исследуемых показателей у хронически облученных людей с разной дозовой нагрузкой у пациентов из второй подгруппы было обнаружено в периферической крови статистически значимое повышение абсолютного количества моноцитов с фенотипом СD14^–CD16⁺ относительно лиц из третьей подгруппы (p* = 0,044), и техногенно не облученных пациентов (р = 0,014) (табл. 2).

Однако в процессе анализа результатов количественной оценки субпопуляций моноцитов у обследованных лиц с различной дозовой нагрузкой не было выявлено статистически значимых различий между медианными значениями исследуемых показателей в основной группе и группе сравнения.

Результаты количественного анализа субпопуляций натуральных киллеров, экспрессирующих молекулы активации CD8 и CD38 на клеточных мембранах, у обследованных лиц с разной поглощенной дозой облучения представлены в таблице 3.

Несмотря на то что у хронически облученных людей из основной группы относительно группы сравнения наблюдалось снижение медианного содержания натуральных киллеров, не экспрессирующих молекулы CD38 и CD8, и абсолютного количества CD38⁺ НК, статистической значимости различий не установлено по причине существенного разброса индивидуальных значений у людей из основной группы при относительно небольших размерах выборок, доверительные интервалы медианных величин перекрываются.

Вместе с тем не установлено статистически значимых различий между относительным и абсолютным количеством натуральных киллеров, экспрессирующих в различных комбинациях молекулы CD8 и CD38 на клеточной мембране, у хронически облученных людей из разных дозовых подгрупп и у лиц из группы сравнения.

При исследовании зависимости «доза–эффект» были обнаружены слабые обратные корреляционные связи между дозой, рассчитанной на ККМ, и относительным, абсолютным количеством моноцитов, абсолютным количеством моноцитов СD14⁺CD16^– и СD14⁺CD16⁺ и относительным количеством CD3^–CD16⁺CD56⁺CD8^–СD38^– клеток. Прямая слабая корреляционная связь была выявлена между относительным количеством НК и дозой, рассчитанной на ККМ. Корреляционные связи между исследуемыми показателями врожденного иммунитета и дозами облучения ККМ и ТиПЛО не были статистически значимыми. С целью уточнения результатов анализа зависимости исследуемых показателей врожденного иммунитета от доз облучения выборка обследуемых лиц будет расширена. У хронически облученных людей в отдаленные сроки после начала радиационного воздействия не было установлено статистически значимых корреляционных зависимостей по критерию Спирмена между количественными характеристиками лейкоцитов, лимфоцитов и моноцитов, а также проанализированных субпопуляций моноцитов и натуральных киллеров и такими факторами нерадиационной природы, как возраст, пол и этническая принадлежность, за исключением показателей, приведенных в таблице 4.

Данные, представленные в таблице 4, показывают наличие у людей из основной группы статистически значимой положительной связи возраста на момент обследования и доли неактивированных НК, а также отрицательной связи между этнической принадлежностью испытуемых и долей СD14^–CD16⁺ моноцитов в периферической крови. Вместе с тем установлена достоверная связь между полом испытуемых и относительным, абсолютным количеством клеток в субпопуляции неактивированных НК и долей НК, одновременно экспрессирующих молекулы CD8 и СD38 на клеточной мембране. У людей из группы сравнения подобные корреляции не выявлены.

Результаты являются предварительными. В процессе работы исследуемые группы будут увеличены.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты исследования согласуются с ранее полученными результатами иммунологических обследований хронически облученных людей из когорты реки Течи и дополняют их. При этом основным дозообразующим радионуклидом был остеотропный стронций-90 (⁹⁰Sr), характерной особенностью которого является длительный период полураспада (около 30 лет), кумуляция в костной ткани и длительное воздействие ИИ на центральный орган иммунной системы и гемопоэза — ККМ. Уникальный характер радиационного воздействия, а именно сочетание внешнего γ-излучения и внутреннего, преимущественно β-излучения за счет ⁹⁰Sr, по всей видимости, и лежит в основе долговременных изменений со стороны иммунной системы у жителей когорты реки Течи. Не выявлено изменений абсолютного количества лейкоцитов, относительного и абсолютного содержания моноцитов в крови между облученными и необлученными участниками исследования.

Субпопуляционный состав моноцитов и экспрессия молекул активации на натуральных киллерах в периферической крови людей из когорты реки Течи в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия исследуется впервые.

Моноциты/макрофаги — гетерогенный кластер клеток, обладающих большой пластичностью и множеством функций, обусловленных типом активирующего сигнала. Это радиорезистентные клетки, функции которых могут модулироваться воздействием (ИИ): в зависимости от дозы облучения и фракционирования эти клетки выполняют про- или противовоспалительную, про- или противоопухолевую активность. В настоящее время не представляется возможным систематизировать информацию о конкретных радиационно-индуцированных модуляциях моноцитов/макрофагов [16].

Молекула CD14 — разновидность толл-подобных рецепторов (Toll-like receptor, TLR), появляется на ранних стадиях созревания моноцитов и является их специфическим маркером [16]. Дифференцировка классических CD14⁺⁺CD16^– моноцитов происходит из костномозгового миелоидного предшественника. За пределами ККМ они созревают в промежуточные CD14⁺⁺CD16⁺ моноциты, дифференцируются в неклассические CD14⁺CD16⁺⁺ моноциты и далее в виде тканевых макрофагов и дендроцитов осуществляют ремоделирование и репарацию поврежденных тканей [17][18]. Позднее созревание периферических моноцитов сопровождается экспрессией FcγRIII (CD16) на мембране клеток при одновременном снижении количества молекул CD14. При этом экспрессия CD16 сопряжена с повышенной способностью моноцитов к презентации антигена, которая увеличивается с утратой экспрессии CD14 на мембране клеток [7]. Относительно низкая фагоцитарная активность, более высокая способность к выработке цитокинов и презентации антигена у таких клеток обусловлена более высокой экспрессией молекул главного комплекса гистосовместимости второго класса (MHC II) [19].

Субпопуляции моноцитов выполняют разные функции, которые определяются либо состоянием их микроокружения, представляющим сложнейшую цитокино-клеточную систему, либо их линейной дифференцировкой [18]. Функционально все моноциты/макрофаги условно классифицируются на два типа: провоспалительные (М1), которые преимущественно продуцируют ИЛ-18, ИЛ-12, ИЛ-26 и тем самым стимулируют ответы Th1 и Th17, и противовоспалительные (M2), которые в основном продуцируют ИЛ-10 и трансформирующий фактор роста бета (transforming growth factor beta, TGF-β), участвуют в иммунорегуляции и восстановлении тканей. Между этими двумя кластерами клеток существуют множество промежуточных и переходных форм, поддерживается динамический баланс цитокинов в зависимости от текущих потребностей макроорганизма [7].

Способность макрофагов отвечать на различные эндогенные и экзогенные про- и противовоспалительные стимулы обеспечивает высокую гетерогенность их фенотипа. ИФН-γ активирует провоспалительные макрофаги (M1), которые участвуют в Th1-зависимом иммунном ответе на онкотрансформированные клетки-мишени. Противовоспалительные макрофаги (M2) задействованы в иммунных реакциях с участием Th2, процессах репарации и патогенезе некоторых опухолей. В спектр продуцируемых М2-клетками цитокинов входят ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF) и TGF-β, которые при определенных условиях обеспечивают пролиферацию и метастазирование опухолевых клеток. Субпопуляция моноцитов c фенотипом CD14^lowCD16^bright «неклассические моноциты» соответствует противовоспалительным клеткам [7].

Нормальные моноциты/макрофаги играют важную роль в реализации противоопухолевого иммунного надзора, антиген-опосредованно активируя Т-цитотоксические клетки или осуществляя непосредственный лизис опухолевых клеток в активированном состоянии. Активированные макрофаги за счет лизирующих ферментов, синтеза ФНО-α и продукции свободных радикалов проявляют противоопухолевую активность. Промежуточные моноциты в сравнении с моноцитами других субпопуляций являются основными продуцентами ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α, обладают наибольшей способностью к трансэндотелиальной миграции и образованию активных форм кислорода [20, 21].

Известно, что для онкотрансформированных клеток характерна сниженная экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости I класса, что модифицирует ингибирующие сигналы от других рецепторов НК. Активирующие рецепторы НK взаимодействуют со стресс-индуцируемыми протеинами, которые экспрессируются опухолевыми клетками. В НK-клетках происходит запуск секреторного процесса — везикулы цитоплазмы, содержащие сериновые эстеразы (гранзимы А и В), высвобождаются локальным экзоцитозом в пространство между клеткой-эффектором и мишенью. У НК специализированный механизм киллинга трансформированных клеток связан с перфорином, содержащимся внутри гранул, который обладает литической активностью в отношении клеток-мишеней. Сразу после связывания лимфоцита с клеткой-мишенью в ее мембране формируются поры, происходит экзоцитоз гранул НК и выход их содержимого — гранзимов и перфорина. Далее в клетке-мишени запускается каскад литических процессов, что приводит к деградации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и последующей клеточной смерти. Способность НК к синтезу цитокинов, в первую очередь ИФН-γ и других, обусловливает их участие в регуляции других звеньев противоопухолевого иммунитета [11].

В научной литературе обсуждается гипотеза о том, что в отдаленные сроки после воздействия ИИ на организм стареющие клетки (в первую очередь лейкоциты и макрофаги, а также фибробласты и другие) являются одним из основных и постоянных источников активных форм кислорода и активных форм азота в тканях, что способствует поддержанию в них высокого уровня свободных радикалов и может привести к повреждению клеток и субклеточных структур вплоть до фиброза и неопластической трансформации [22][23].

Следует особо подчеркнуть, что выявленные особенности иммунного статуса более выражены у хронически облученных людей с максимальными поглощенными дозами, рассчитанными на ККМ, они были зарегистрированы в период реализации канцерогенных эффектов облучения и могут играть определенную роль в их развитии. Результаты корреляционного анализа влияния факторов нерадиационной природы у людей из исследуемых групп требуют значительной осторожности в интерпретации в связи с относительно небольшим размером выборок — фактором, который вносит значительную неопределенность при оценке парных корреляций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе исследования были выявлены статистически значимые изменения в субпопуляциях моноцитов у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию. В частности, у лиц, облученных в диапазоне доз на ККМ от 250 и до 699 мГр, относительное количество моноцитов с фенотипом CD14^–CD16⁺ было значимо выше, чем в группе сравнения, а их абсолютное количество превышало аналогичный показатель у лиц из третьей подгруппы с максимальной дозовой нагрузкой. Полученные у практически здоровых облученных людей из когорты реки Течи предварительные результаты могут свидетельствовать о некотором латентном напряжении регуляторных механизмов в иммунной системе, в частности системах моноцитов/макрофагов и НК, которые действуют по принципу обратной связи и направлены на компенсацию провоспалительных иммунных сдвигов [23], в меньшей степени выраженных у необлученных лиц.

Абсолютное количество лейкоцитов, относительное и абсолютное количество моноцитов, относительное и абсолютное количество моноцитов с фенотипами СD14⁺CD16^–, СD14⁺CD16⁺, СD14^–CD16⁺ у всех обследованных людей из основной группы и группы сравнения статистически значимо не различались. Относительные и абсолютные количества натуральных киллеров, экспрессирующих в различных комбинациях молекулы CD8 и CD38 на клеточной мембране, статистически значимо не различались у хронически облученных людей и лиц из группы сравнения.

Не выявлено статистически значимых корреляций Спирмена между исследуемыми показателями врожденного иммунитета и факторами радиационной природы у хронически облученных людей.

Исследование субпопуляций моноцитов и натуральных киллеров в периферической крови у хронически облученного населения прибрежной зоны реки Течи будет продолжено.