Сравнение методов очистки фаговых лизатов грамотрицательных бактерий для персонализированной терапии

Фаготерапия является перспективным методом лечения инфекций, вызванных устойчивыми к антибактериальным препаратам бактериями. Для получения безопасных терапевтических препаратов бактериофагов необходима глубокая очистка лизатов от компонентов бактериальной клетки, в частности эндотоксинов. Целью работы было исследовать применимость различных методов очистки фаголизатов для получения терапевтических препаратов. Фаги vB_KpnM_Seu621 (Myoviridae) и vB_KpnP_Dlv622 (Autographiviridae) использовали для получения лизата штамма Klebsiella pneumoniae KP9068. Очистку лизатов проводили методом осаждения бактериофагов с использованием полиэтиленгликоля, ультрацентрифугированием в градиенте CsCl, ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы, с помощью центрифужных концентраторов (100 кДа), концентрированием на целлюлозных фильтрах 0,22 мкм в присутствии MgSO4. Уровень эндотоксинов определяли ЛАЛ-тестированием. В результате действия vB_KpnM_Seu621 и vB_KpnP_Dlv622 были получены лизаты с титром 1,25 × 10¹² ± 7,46 × 1010 и 2,25 × 10¹² ± 1,34 × 10¹¹ БОЕ/мл и концентрацией эндотоксина 3806056 ± 429410 и 189456 ± 12406 ЕЭ/мл соответственно. Из традиционных методов оптимальным по снижению уровня эндотоксина и сохранению концентрации фаговых частиц было ультрацентрифугирование в градиенте CsCl (303 ± 20 – 313 ± 35 ЕЭ/мл, 1,5‒2,75 × 10¹² ± 1,71 × 10¹¹ БОЕ/мл); из альтернативных — очистка в градиенте сахарозы и фильтрация в присутствии MgSO₄. Метод очистки лизатов следует подбирать для каждого препарата бактериофагов отдельно. Из способов очистки лизатов, пригодных для внутривенного и интратекального введения, перспективны метод ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы и фильтрация в присутствии MgSO₄.

1. Tacconelli E, Carrara E, Savoldi A, Harbarth S, Mendelson M, Monnet DL, et al. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis. Lancet Infect Dis. 2018; 18 (3): 318–27. DOI: 10.1016/S1473-3099(17)30753-3.

2. Lin DM, Koskella B, Lin HC. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World J Gastrointest Pharmacol Ther. 2017; 8 (3): 162. DOI: 10.4292/wjgpt.v8.i3.162.

3. Акимкин В. Г., Дарбеева О. С., Колков В. Ф. Бактериофаги: исторические и современные аспекты их применения: опыт и перспективы. Клиническая практика. 2010; 4 (4): 48–54.

4. Pirnay JP, Blasdel BG, Bretaudeau L, Buckling A, Chanishvili N, Clark JR, et al. Quality and safety requirements for sustainable phage therapy products. Pharm Res. 2015; 32 (7): 2173–9. DOI: 10.1007/s11095-014-1617-7.

5. Шкода А. С., Митрохин С. Д., Ведяшкина С. Г., Орлова О. Е., Бастрикин С. Ю., Галицкий А. А., и др. Персонализированная фаготерапия пациентов, страдающих инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи: методические рекомендации. 2019; 37 с. Доступно по ссылке: https://niioz.ru/upload/iblock/259/259f65904e633b948cd2e6a1d04742f0.pdf.

6. Petrovic-Fabijan A, Khalid A, Maddocks S, Ho J, Gilbey T, Sandaradura I, et al. Phage therapy for severe bacterial infections: a narrative review. Med J Aust. 2020; 212 (6): 279–85. DOI: 10.5694/mja2.50355.

7. Aleshkin AV, Shkoda AS, Bochkareva SS, Ershova ON, Mitrokhin SD, Kiseleva IA, et al. Concept of individualized medicine based on personalized phage therapy for intensive care unit patients suffering from healthcare-associated infections. Infektsionnye Bolezni. 2017; 15 (4): 49–54. DOI: 10.20953/1729-9225-2017-4-49-54.

8. Rietschel ET, Kirikae T, Schade FU, Mamat U, Schmidt G, Loppnow H, et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB J. 1994; 8 (2): 217–25. DOI: 10.1096/FASEBJ.8.2.8119492.

9. Raetz CRH, Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev Biochem. 2002; 71 (1): 635–700. DOI: 10.1146/annurev. biochem.71.110601.135414.

10. Luong T, Salabarria AC, Edwards RA, Roach DR. Standardized bacteriophage purification for personalized phage therapy. Nat Protoc. 2020; 15 (9): 2867–90. DOI: 10.1038/s41596-020-0346-0.

11. Guo Y, Cheng A, Wang M, Zhou Y. Purification of anatid herpesvirus 1 particles by tangential-flow ultrafiltration and sucrose gradient ultracentrifugation. J Virol Methods. 2009; 161 (1): 1–6. DOI: 10.1016/J.JVIROMET.2008.12.017.

12. Hietala V, Horsma-Heikkinen J, Carron A, Skurnik M, Kiljunen S. The Removal of Endo- and Enterotoxins From Bacteriophage Preparations. Front Microbiol. 2019; 10: 1674. DOI: 10.3389/fmicb.2019.01674.

13. Van Belleghem JD, Merabishvili M, Vergauwen B, Lavigne R, Vaneechoutte M. A comparative study of different strategies for removal of endotoxins from bacteriophage preparations. J Microbiol Methods. 2017; 132: 153–9. DOI: 10.1016/j.mimet.2016.11.020.

14. Van Twest R, Kropinski AM. Bacteriophage enrichment from water and soil. Methods Mol Biol. 2009; 501: 15–21. DOI: 10.1007/978-1-60327-164-6_2.

15. Cooper CJ, Denyer SP, Maillard J-Y. Stability and purity of a bacteriophage cocktail preparation for nebulizer delivery. Lett Appl Microbiol. 2014; 58 (2): 118–22. DOI: 10.1111/lam.12161.

16. Merabishvili M, Pirnay J-P, Verbeken G, Chanishvili N, Tediashvili M, Lashkhi N, et al. Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS One. 2009; 4 (3): 4944. DOI: 10.1371/JOURNAL.PONE.0004944.

17. Brisse S, Passet V, Haugaard AB, Babosan A, Kassis-Chikhani N, Struve C et al. Wzi gene sequencing, a rapid method for determination of capsulartype for klebsiella strains. J Clin Microbiol. 2013; 51 (12): 4073–8. DOI: 10.1128/JCM.01924-13.

18. Gorodnichev RB, Volozhantsev NV, Krasilnikova VM, Bodoev IN, Kornienko MA, Kuptsov NS, et al. Novel Klebsiella pneumoniae K23-specific bacteriophages from different families: similarity of depolymerases and their therapeutic potential. Front Microbiol. 2021; 12: 669618. DOI: 10.3389/FMICB.2021.669618.

19. Mazzocco A, Waddell TE, Lingohr E, Johnson RP. Enumeration of bacteriophages using the small drop plaque assay system. Bacteriophages. 2009; 81–85. DOI: 10.1007/978-1-60327-164-6.

20. Maniatis T, Sambrook J, Fritsch EF. Molecular cloning: a laboratory manual. 2th ed. Inglis J. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1984; 2230 p.

21. Schooley RT, Biswas B, Gill JJ, Hernandez-Morales A, Lancaster J, Lessor L, et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrob Agents Chemother. 2017; 61 (10): 1–15. DOI: 10.1128/AAC.00954-17.

22. Dedrick RM, Guerrero-Bustamante CA, Garlena RA, Russell DA, Ford K, Harris K, et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med Springer US. 2019; 25 (5): 730–33. DOI: 10.1038/s41591-019-0437-z.

23. Rubalskii E, Ruemke S, Salmoukas C, Boyle EC, Warnecke G, Tudorache I, et al. Bacteriophage therapy for critical infections related to cardiothoracic surgery. Antibiotics. 2020; 9 (5): 1–12. DOI: 10.3390/ANTIBIOTICS9050232.

24. Pinto AM, Cerqueira MA, Bañobre-Lópes M, Pastrana LM, Sillankorva S. Bacteriophages for chronic wound treatment: from traditional to novel delivery systems. Viruses. 2020; 12 (2): 1–29. DOI: 10.3390/v12020235.

25. Wills QF, Kerrigan C, Soothill JS. Experimental bacteriophage protection against Staphylococcus aureus abscesses in a rabbit model. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49 (3): 1220–1. DOI: 10.1128/AAC.49.3.1220-1221.2005.

26. Fish R, Kutter E, Wheat G, Blasdel B, Kutateladze M, Kuhl S. Bacteriophage treatment of intransigent diabetic toe ulcers: a case series. Journal of wound care. 2016; 25 (Sup 7): 27–33. DOI: 10.12968/JOWC.2016.25.SUP7.S27.

27. ОФС.1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины. Фармакопея. рф [Электронный ресурс]. Доступно по ссылке: https:// pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0006-15-bakterialnye-endotoksiny/(дата обращения: 30.08.2021).

28. Zhang ZR, Shen JT, Dai JY, Sun YQ, Dong YS, Xiu ZL. Separation and purification of Klebsiella phage by two-step salting-out extraction. Sep Purif Technol. 2020; 242 (2): 116784. DOI: 10.1016/j.seppur.2020.116784.

29. Bergstrand A, Svanberg C, Langton M, Nydén M. Aggregation behavior and size of lipopolysaccharide from Escherichia coli O55:B5. Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2006; 53 (1): 9–14. DOI: 10.1016/J.COLSURFB.2006.06.007.