Лиофилизированная плазма для оказания экстренной трансфузиологической помощи в экстремальных условиях

ВВЕДЕНИЕ

Для раненых и пострадавших с массивной кровопотерей крайне важна доступность гемокомпонентной терапии уже на этапах медицинской эвакуации [1][2]. С целью лечения посттравматической коагулопатии обосновано использование донорской плазмы как источника физиологических прокоагулянтов и антикоагулянтов, активаторов и ингибиторов фибринолиза [3–5]. Применение свежезамороженной плазмы (СЗП) в экстремальных условиях, в удаленных и труднодоступных районах, на море, во время авиационной транспортировки затруднено из-за сложности логистики и невозможности обеспечения холодовой цепи. Ограниченность использования СЗП связана также с хрупкостью контейнеров с замороженным гемокомпонентом и высоким риском их повреждения во время перегрузки при транспортировке и оттаивании плазмы. До 40% контейнеров списывается из-за брака [6]. Гемокомпонент перед трансфузией должен быть обязательно разморожен и согрет, что требует временных затрат и специального оборудования. Аналогичные проблемы при оказании трансфузиологической помощи возникают и в случаях массового поражения населения из-за стихийных бедствий или техногенных катастроф, сопровождающихся разрушением инфраструктуры [4–8].

В условиях ограниченных возможностей применения СЗП в экстремальных условиях важны преимущества использования сухой плазмы, к которым относятся отсутствие специального оборудования для транспортировки и подготовки к трансфузии, гемокомпонент имеет длительный срок годности, что повышает доступность и оперативность оказания трансфузиологической помощи при жизнеугрожающих состояниях [4–8].

Одним из способов получения сухой плазмы является лиофилизация [9]. Жидкий гемокомпонент подвергают шоковой заморозке, затем сублимационному высушиванию при низком вакууме (менее 35 Па). Удаление из продукта растворителя путем его перевода из замороженного состояния в газообразное происходит при постепенном нагревании в диапазоне температур от минус 45 до плюс 35 °С, что позволяет снизить потери функциональной активности целевых белков в процессе обезвоживания.

Лиофилизированная плазма (ЛП) внесена в перечень компонентов крови, утвержденный постановлением Правительства Российской Федерации от 22.06.2019 № 797¹.

Еще одним способом обезвоживания биоматериала является распылительное высушивание, когда плазма диспергируется в потоке горячего воздуха при температуре 60–150 °С [5][7][10][11]. Метод имеет простое аппаратурное оснащение и высокую производительность в сравнении с технологией сублимационного высушивания. Однако плазма, обезвоженная таким способом, в европейских странах не выпускается, в США находится на стадии разработки и клинических испытаний [10][11]. В Российской Федерации (РФ) «спрей-плазма» не входит в перечень компонентов крови².

Эффективность применения ЛП во многом зависит от сохранности факторов свертывания крови, естественных антикоагулянтов и других белков, обеспечивающих плазменный гемостаз [3–5]. В России ЛП возможно получать из карантинизированной или патогенредуцированной плазмы³. Технологический процесс при этом включает шоковую заморозку, оттаивание и повторное замораживание, воздействие света и химических агентов для инактивации патогенов, а также непосредственно сублимационное высушивание. Эти этапы оказывают значительное влияние на структуру и функциональную активность белков плазмы, особенно термолабильных, к которым относятся факторы свертывания крови [4][5][7][12]. В связи с этим важен обоснованный подбор технологических параметров процесса получения ЛП с максимально сохраненным коагуляционным потенциалом и показателями безопасности, соответствующими нормативным требованиям.

Цель исследования — анализ перспективных направлений совершенствования технологий получения лиофилизированной плазмы с использованием международного и отечественного опыта производства, оценки контроля качества и применения гемокомпонента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поиск литературы осуществляли в электронных библиографических базах данных на русском (eLibrary, CyberLeninka) и английском (PubМed, Web of Science, Scopus) языках и в патентных источниках информации (Google Patent Search, ФИПС). Поисковые запросы включали ключевые слова: лиофилизированная плазма, технология получения, лиофилизация, коагуляционный потенциал, трансфузионная терапия (lyophilized plasma, technology of obtaining, lyophilization, coagulation potential, transfusion therapy). Глубина поиска составила 10 лет. В обзор включены публикации, содержащие информацию о технологиях получения лиофилизированной плазмы и перспективных разработках в данной области.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первые опыты получения и применения лиофилизированной плазмы

Технология получения ЛП разработана в 1930-е гг. [3][5][7][8][13][14]. В 1939 г. в Ленинградском институте переливания крови (с 2011 г. — Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства) в лаборатории под руководством профессора Л.Г. Богомоловой создан один из первых в мире сублимационных аппаратов камерного типа, что стало важным этапом развития лиофилизации в нашей стране [14]. Исследования по лиофилизации плазмы крови и разработка аппаратурного оснащения процесса также велись в Великобритании, США, Канаде и других странах [3][5][7][8][13].

Широкомасштабное производство ЛП началось во время Второй мировой войны. Миллионы единиц сухого гемокомпонента были поставлены из США и Великобритании союзным войскам [5–8]. В СССР, даже во время блокады, в Ленинграде (1941–1944 гг.) осуществлялось производство ЛП, прежде всего для нужд Балтийского флота. Гемокомпонент получали преимущественно из плазмы крови четвертой группы АВ(IV), фасовали в стеклянные бутылки или
ампулы [14, 15].

В СССР ЛП в промышленных масштабах производилась с 1960-х гг. Плазму получали согласно типовому регламенту производства. Предварительное замораживание осуществляли в стеклянных флаконах в спиртовых ваннах. Для распределения плазмы по поверхности флакона емкости вращали под углом 3–5° вокруг горизонтальной оси. Это позволяло получать максимально тонкий слой замороженного продукта и увеличить поверхность испарения. Такой подход, а также подобранный режим лиофилизации позволяли уже в течение 20–26 или 28–32 ч, в зависимости от используемой лиофилизационной установки, обезвоживать плазму до показателя остаточной влажности менее 1%. Все технологические операции проводили с соблюдением правил асептики и контролем стерильности. Для лучшей сохранности белков плазмы крови в процессе лиофилизации использовали защитную среду на основе глюкозы. Стерильный раствор этого моносахарида (5 или 40%) добавляли в соотношении 1:9 к плазме [9][16].

Контроль готовой продукции осуществляли по следующим показателям качества: «растворимость» — не более 10 мин., «подлинность» — образование плотного сгустка в присутствии 5%-го раствора кальция хлорида (качественная реакция на наличие фибриногена), «остаточная влажность» — менее 1%, «стерильность» — стерильно, «общий белок» — не менее 55 г/л. Срок годности ЛП составлял 5 лет при температуре хранения от 5 до 25 °С. По результатам исследования стабильности гемокомпонента по истечении 8 лет хранения установлено повышение времени растворения в 2,5 раза без превышения норм (с 4 до 10 мин.), остальные показатели изменялись несущественно. Значение рН ЛП было близким к нейтральному — 7,5 ± 0,2 [9]. Однако стоит отметить, что в 1960-е гг. не существовало возможности оценки показателей системы гемостаза, их уровень в производственных партиях не нормировался, а срок годности устанавливался без учета динамики активности термолабильных белков при хранении.

Применялась ЛП в основном в тех случаях, когда не было возможности переливать донорскую кровь; ее использование показало свою эффективность у раненых с острой кровопотерей и травматическим шоком. Прекращение массового производства ЛП пришлось на 1980-е гг. в связи с выявлением случаев передачи гемотрансмиссивных инфекций (ГТИ). Предпринимались попытки снижения риска заражения реципиентов путем удаления вирусов, уменьшения размеров пулов плазмы, но они были малоэффективны [3][5–8].

Развитие технологий получения лиофилизированной плазмы

Благодаря внедрению надежных стандартизованных методов обеспечения вирусной безопасности начался новый этап развития данного направления. В 1991 г. для удовлетворения потребности в трансфузиях крови и ее компонентов при проведении военных операций в Персидском заливе было возобновлено производство ЛП во Франции [5–8]. Безопасность обеспечивали за счет формирования небольших пулов плазмы (менее чем от 11 доноров) с контролем отсутствия маркеров ГТИ, карантинизацией плазмы и повторным обследованием доноров. Дополнительной мерой повышения безопасности гемокомпонента было введение скрининга плазмы крови от лиц женского пола на наличие антител к человеческому лейкоцитарному антигену.

Французский военный институт крови (French Military Blood Institute) производит ЛП под торговым наименованием FLyP. Это пулированная, патогенредуцированная с использованием амотосалена и облучения ультрафиолетом, универсальная по системе ABО ЛП. С целью обеспечения требуемого уровня фактора VIII в сухом гемокомпоненте с учетом влияния патогенредукции предпочтение отдают СЗП с активностью не менее 0,96 МЕ/мл [17]. Отобранные дозы после размораживания объединяют в пул, асептически разливают в стеклянные флаконы и сублимационно высушивают. Продолжительность процесса лиофилизации составляет 4–6 суток [17–20].

В начале 1990 гг. служба переливания крови Немецкого Красного Креста начала выпуск пулированной ЛП (до 1000 доноров), обработанной сольвент-детергентным методом. Из-за опасений, связанных с тем, что применяемая технология не инактивирует прионы — возбудители болезни Крейцфельдта — Якоба, с 2007 г. пулированная плазма заменена на монодонорский продукт ЛП. В настоящее время LyoPlas N-w представляет собой карантинизированную ЛП одного донора. Плазма хранится в замороженном виде не менее 4 месяцев до повторного обследования донора, затем ее размораживают, подсоединяют к запатентованной системе стерильного розлива, состоящей из стеклянного флакона и резиновой пробки внутри полиэтиленового пакета [5–8][20]. Во флакон через фильтр с номинальным размером пор 0,2 мкм переливают 200 мл плазмы, флакон закрывают пробкой и удаляют из системы. Затем плазму замораживают до минус 30 °C. Высушивание происходит при ступенчатом повышении температуры от минус 45 до плюс 15 °C в течение 6 суток, остаточная влажность плазмы составляет не более 1% [5][20].

Коммерческий продукт Bioplasma FDP производится Национальным институтом биопродуктов Южной Африки с 1996 года. Это пулированная, обработанная сольвент-детергентным методом, универсальная по системе ABО ЛП [6–8][20].

С 2016 г. в Республиканском научно-практическом центре трансфузиологии и медицинской биотехнологии Республики Беларусь активно ведется разработка пулированной (не менее 10 единиц плазмы), патогенредуцированной (фотохимическая обработка с использованием рибофлавина или амотосалена), стандартизованной по содержанию фибриногена ЛП. Для снижения потерь факторов свертывания крови в процессе лиофильного высушивания в промежуточный продукт добавляют вспомогательные вещества, состав которых не раскрывается [21][22].

Швейцарская компания Octapharma AG получила одобрение регулирующих органов Европы на производство ЛП OctaplasLG Lyo [23]. Ее получают из пула, состоящего из 630–1520 единиц одногруппной донорской плазмы, которую фильтруют для удаления агрегатов и клеточных фрагментов. Для обеспечения вирусной безопасности используют сольвент-детергентный метод обработки. Принципиальным отличием технологии от ранее описанных является стадия хроматографической очистки с использованием аффинных лигандов к прионным белкам. Плазму подвергают стерилизующей фильтрации и розливу в апирогенные стеклянные флаконы по 200–210 мл, затем лиофилизируют. Следует отметить, что этапы производства OctaplasLG Lyo сопровождаются корректировкой рН с использованием лимонной или фосфорной кислоты для компенсации повышения этого показателя в процессе лиофилизации. В качестве стабилизатора используют глицин в конечной концентрации 5 г/л. Перед применением ЛП регидратируют в 190 мл воды для инъекций [20][24].

В КНР запатентованы технологии лиофилизации плазмы, в том числе обогащенной тромбоцитами (Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS, First Medical Center of PLA General Hospital, Qilu Cell Therapy Technology Co ltd Yinfeng Biological Group Ltd). Высушивание гемокомпонента проводят в течение 4–6 суток. Материал охлаждают до минус 45 °C, затем постепенно нагревают до плюс 20 °C при значении вакуума 0,1 мбар. На стадии вторичной сушки (досушивания) давление снижают до 0,001 мбар, температуру поднимают до плюс 25 °C [25–27].

Представленные продукты ЛП производят в стеклянных флаконах. Недостатки данной упаковки — хрупкость, объемность и значительная масса. Требуется аккуратность при транспортировке, что довольно сложно обеспечить в экстремальных условиях. Кроме того, для проведения стадии розлива и непосредственно лиофилизации необходимо создать асептические условия для предотвращения контаминации продукта [28][29].

Инновационные технологии получения лиофилизированной плазмы в полимерных контейнерах

Неудобства транспортировки и применения ЛП в стеклянных флаконах создали предпосылки для появления инновационных технологий получения гемокомпонента в полимерных контейнерах. Легкость, компактность, прочность и герметичность таких расходных систем повышает доступность и оперативность ранней трансфузионной терапии в экстремальных ситуациях вне стационарных условий. На сегодняшний день наиболее перспективным направлением считается использование мембранной технологии лиофилизации, когда одна из поверхностей контейнера изготавливается из газопроницаемого полимера. Такой материал обладает высокой гидрофобностью, не токсичен, препятствует проникновению микроорганизмов и в то же время проницаем для паров воды. Все это позволяет изготавливать ЛП в замкнутой системе с сохранением контура стерильности и обеспечивает преимущества использования сухого гемокомпонента в экстремальных условиях [8][28][29].

За рубежом приоритет в области разработки технологий получения ЛП в полимерных контейнерах принадлежит США. В 2007 и 2008 гг. Управление по разработке медицинского оборудования для армии и командование специальных операций начали финансирование программ по производству ЛП в полимерных контейнерах. С 2008 по 2013 г. партнером Министерства обороны США выступала компания HemCon Medical Texnologies, Inc. Несмотря на то что пулирование плазмы обеспечивало ее стандартизацию по уровню факторов свертывания крови, предпочтение было отдано ЛП, полученной от одного донора. В 2011 г. этот продукт успешно прошел I фазу клинических испытаний. Однако вскоре сотрудничество с HemCon Medical Technologies, Inc. было прекращено. В 2014 г. совместно с новым партнером Vascular Solutions, Inc. разработана ЛП с коммерческим названием RePlas, которая в настоящее время прошла I фазу клинических испытаний [5][7][20][30]. Известен еще один продукт данной компании — ЛП одного донора EZPLAZ [8].

Биотехнологическая компания Terumo BCT Biotechnologies, LLC получила финансирование в 2016 г. на разработку децентрализованного производства ЛП в полимерных контейнерах из пулов плазмы (до 10 доноров) для использования в центрах крови и при экстремальных ситуациях. В настоящее время разработанная этой компанией технология и расходные материалы для получения ЛП применяются не только в США, но и в Канаде [31–33].

Газопроницаемая мембрана разработанных в США полимерных контейнеров для лиофилизации изготавливается на основе вспененного политетрафторэтилена (e-PTFE). Выбор этого материала обусловлен его пористой и гибкой структурой, химической стабильностью и биосовместимостью [34]. Наличие отрицательных зарядов на поверхности полимера блокирует коагуляцию белков крови и ограничивает активацию тромбоцитов. Размер пор мембраны контейнера для лиофилизации находится в диапазоне 0,2–0,3 мкм, что обеспечивает защиту продукта от микробной контаминации. Пористость 50–95% позволяет эффективно отводить пары жидкости. Разработанные контейнеры представлены в двухсекционном исполнении. Одна из частей оснащена газопроницаемой мембраной, другая выполнена из «недышащего» полимерного материала, такого как поливинилхлорид или полипропилен. Для повышения эффективности сублимации в ходе процесса плазма не контактирует с поверхностью мембраны [35–37].

Конструкция контейнеров Terumo BCT Biotechnologies, LLC может включать в себя временное уплотнение в виде армирующей вставки, разделяющей часть контейнера с плазмой и незаполненную секцию с «дышащей» мембраной. Зона окклюзии в этом случае необходима для создания воздушного пространства с целью ускорения оттока паров растворителя в процессе сублимации [35][36]. В конструкции контейнеров Teleflex Inc. может быть предусмотрено приспособление в виде каркаса из инертного медицинского пластика, поддерживающего мембрану над слоем плазмы [37].

Продолжительность высушивания плазмы в указанных полимерных контейнерах сопоставима с длительностью лиофилизации во флаконах: от 4 до 7 дней. После лиофилизации сухой продукт находится в «недышащей» части контейнера (при необходимости пересыпается в нее), которая отделяется от секции с мембраной герметичным швом. Контейнер, в котором хранится ЛП, снабжен необходимыми портами для ввода растворителя и переливания регидратированной плазмы [35–37].

В РФ также известен ряд разработок в области лиофилизации плазмы в полимерных контейнерах. В 2021 г. ООО «Гемодженикс» запатентована система, представляющая собой контейнер из двух секций, герметично соединенных отслаиваемым термосварным швом, что дает возможность лиофилизации, хранения и использования гемокомпонента с сохранением контура стерильности [38]. В качестве воздухопроницаемого материала используется нетканый полимер «Тайвек», выполняющий функцию мембраны. Высушивание плазмы проводят в газопроницаемой части контейнера. Вторая секция, в которую пересыпают лиофилизат по окончании процесса, изготовлена из поливинилхлорида и используется для хранения, транспортировки и переливания гемокомпонента. Аналогичный принцип реализован компанией ООО «НПО «Биотех-М» при разработке способа лиофилизации плазмы в двухсекционном контейнере, отличающемся конструктивными особенностями межсекционного шва, другим составом «дышащего» материала, конфигурацией портов и магистралей [39]. Позднее авторы отметили, что основным недостатком бинарных контейнеров является их большая площадь, что требует существенного увеличения рабочей поверхности лиофилизационной камеры. Применяемые для изготовления мембраны материалы гигроскопичны, поэтому пересыпание ЛП из одной секции в другую может приводить к значительному повышению влажности гемокомпонента [40].

Односекционные контейнеры просты в изготовлении, лишены перечисленных недостатков. В настоящее время они зарегистрированы как медицинское изделие «Лиокон» (ООО «НПО «Биотех-М», Россия) и применяются для высушивания плазмы по протоколу, интегрированному в программное обеспечение лиофилизационной установки «Лиомед» того же производства. Контейнеры выполнены в виде уплощенной емкости площадью около 420 см² (линейный размер 15,5×27,3 см). Одна из его поверхностей изготовлена из водо-, газо- и паронепроницаемого материала, другая представляет собой мембрану с размером пор в диапазоне от 0,1 до 0,45 мкм и пористостью от 20 до 80%. Лиофильное высушивание плазмы в этих контейнерах ведут при температуре от минус 40 до плюс 37 °С в течение 4–7 суток. После завершения лиофилизации необходима немедленная герметизация поверхности мембраны. Для дополнительной защиты от попадания влаги из окружающей среды и повреждений при хранении и транспортировке контейнер помещают во внешний пакет и вакуумируют [41].

В учреждениях Федерального медико-биологического агентства (ФМБА России) ведутся исследования по разработке технологий получения ЛП в полимерных контейнерах [42]. С 2024 г. в Кировском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови ФМБА России выполняются работы по получению сухого гемокомпонента с повышенным коагуляционным потенциалом с использованием мембранной технологии в составе универсальной укладки для оказания экстренной трансфузиологической помощи раненым и пострадавшим с массивной кровопотерей в экстремальных ситуациях.

Применение технологий патогенредукции для обеспечения инфекционной безопасности лиофилизированной плазмы

Технологии патогенредукции позволяют повысить инфекционную безопасность гемокомпонента, поскольку направлены на удаление широкого спектра вирусов, а не только четырех ГТИ, выявление которых обязательно при медицинском обследовании доноров [5][43]. Имеются данные о том, что современные технологии предотвращают гемотрансмиссивный бактериальный сепсис. Введение этапа патогенредукциии исключает длительный период карантинизации, позволяет избежать выбраковки гемокомпонента по причине неявки донора на повторное обследование и влечет за собой сокращение времени получения пригодного для клинического применения гемокомпонента [43].

С точки зрения обеспечения вирусной безопасности предпочтительно производство монодонорской ЛП. Однако широкая вариабельность физиологических показателей плазмы затрудняет обеспечение качества готового гемокомпонента. Объединение единиц плазмы в пул позволяет стандартизовать продукт по содержанию общего белка, факторов свертывания крови, фибриногена, естественных антикоагулянтов. В этом случае особое значение приобретает введение этапа патогенредукции [7][28].

Для обработки пулов плазмы (до сотен и тысяч единиц) применяется сольвент-детергентный метод, внедренный в 1991 г. в качестве альтернативы карантинизации. Недостатком способа является снижение активности естественных антикоагулянтов: протеина S до 44% и α₂-антиплазмина до 79% [44].

Для обработки индивидуальных единиц плазмы и пулов до 2–3 единиц применяют методы, основанные на фотоинактивации патогенов. Обработка видимым светом и метиленовым синим (система THERAFLEX, Macopharma, Франция) используется для доз плазмы объемом 235–315 мл, облучение ультрафиолетом с добавлением рибофлавина (система Mirasol, Terumo BCT, США) — для доз плазмы объемом 170–360 мл, ультрафиолет в комплексе с амотосаленом (система INTERCEPT, Cerus Corporation, США) — для аферезных доз плазмы объемом не более 650 мл или пулированной плазмы объемом 385–650 мл, полученной из цельной крови [43].

В результате сравнения фотохимических технологий патогенредукции установлено, что представленные методы оказывают влияние на коагуляционный потенциал плазмы [43]. В 2014 г. Jose Coene et al. отметили снижение концентрации фибриногена (от 16,8 до 33,2%), активности факторов II (от 2,2 до 22,6%), V (от 7,8 до 38,2%), VIII (от 22,3 до 44,7%), IX (от 9,2 до 33,9%) и XI (от 14,8 до 47,4%). Наибольшее изменение гемостатических свойств плазмы показано при облучении ультрафиолетом и обработке рибофлавином [45]. Такая же тенденция наблюдалась при изучении коагуляционного потенциала патогенредуцированной ЛП, выпускаемой в Республике Беларусь, с применением систем Mirasol и INTERCEPT. Падение активности фактора VIII составило 39,3 и 19%, а снижение содержания фибриногена — 33,6 и 25,3% соответственно [21]. По данным И.А. Кривова и соавт. (2020), при высушивании плазмы в стеклянных флаконах объемом 10 мл и использовании трех методов патогенредукции установлено отсутствие значимого влияния способа вирусинактивации биоматериала на сохранность его гемостатических свойств. В целом отмечено падение активности факторов V и VIII на 18–20 и 15–19% соответственно, а также увеличение ПВ и АЧТВ по сравнению с этими же показателями в СЗП. Остальные параметры оставались в пределах физиологической нормы [46].

Внедрение технологий патогенредукции требует наличия специального оборудования и дорогостоящих расходных материалов. Вместе с тем экономические затраты обоснованы повышением безопасности, снижением продолжительности процесса получения ЛП, а также более рациональным использованием донорского ресурса [43][46].

Получение лиофилизированной плазмы групповой принадлежности (IV)

Обязательным условием применения ЛП является совместимость по системе АВО донора и реципиента. Применение в экстремальных условиях плазмы групповой принадлежности АВ(IV) дает преимущество во времени и снижает риск переливания несовместимого по группе крови гемокомпонента. Поэтому наиболее востребовано трансфузиологическое обеспечение гемокомпонентом групповой принадлежности АВ(IV). Использование такой ЛП позволяет незамедлительно проводить трансфузию [6][28][29].

Согласно литературным данным, распространенность группы крови АВ(IV) среди населения составляет всего 8–9%. Для повышения доступности трансфузий плазмы в экстремальных ситуациях за рубежом в качестве «универсальной» разрешается применять плазму с низким титром анти-А антител или объединять в определенных соотношениях плазму групп А, В и АВ. Например, известен способ формирования пула для получения ЛП с относительным содержанием индивидуальных единиц плазмы группы А(II) — 40–45%, группы В(III) — 40–45%, группы АВ(IV) — 10–20% [6][17][19][28][29].

В соответствии с ПП РФ от 22.06.2019 № 797⁴ при отсутствии одногрупповой плазмы допускается трансфузия плазмы только группы АВ(IV). В связи с этим для российского здравоохранения стратегическое значение имеет формирование резерва донорской плазмы групповой принадлежности АВ(IV).

Изучение свойств лиофилизированной плазмы

В процессе лиофилизации плазмы важно максимально сохранить ее коагуляционный потенциал: активность факторов свертывания крови и естественных антикоагулянтов, концентрацию фибриногена. При этом результаты исследований могут рассматриваться в комплексе с данными глобальных коагулологических тестов, таких как тромбоэластография. В готовом продукте контролируют влажность. Считается, что при значении этого показателя менее 2% обеспечивается стабильность ЛП при длительном хранении. Определяют количество общего белка, проводят испытание на стерильность. Помимо основных показателей качества, о физико-химических свойствах и составе ЛП судят по времени растворения, рН, осмолярности и остаточным концентрациям вспомогательных веществ.

При изучении свойств FLyP получены следующие значения показателей коагуляционного потенциала: концентрация фибриногена 2,4 ± 0,3 г/л; активность фактора V 0,51 ± 0,16 МЕ/мл; фактора VIII — 0,62 ± 0,10 МЕ/мл; фактора IX — 0,79 ± 0,11 МЕ/мл; фактора XIII — 1,03 ± 0,12 МЕ/мл; протеина С — 96 ± 9%; протеина S — 77 ± 16%; антитромбина III — 1,01 ± 0,05%; α₂-антиплазмина — 95 ± 30%. При этом из девяти исследуемых показателей только для двух снижение в процессе лиофилизации было значимым. Активность фактора V упала на 25 ± 12%, фактора VIII — на 20 ± 7%. Остальные параметры были стабильны или изменялись в пределах 7%. Также наблюдалась пролонгация АЧТВ на 11% и ПВ — на 8%, что ассоциировано со снижением активности факторов V и VIII [17][18][20].

Данные тромбоэластографии для СЗП и FLyP схожи, что свидетельствует о сохранности гемостатических свойств гемокомпонента после лиофилизации [18]. Влажность ЛП не превышает 2%. Лиофилизат растворяется в 200 мл воды для инъекций менее чем за 6 минут. Значение рН регидратированного гемокомпонента смещено в щелочную область — порядка 8. Срок хранения ограничен 2 годами при комнатной температуре [4][17][18]. При изучении стабильности FLyP показано, что при повышенной температуре окружающей среды, 38–53 °С, наиболее подвержена изменению активность факторов VIII и V, а также концентрация фибриногена [14].

В процессе получения ЛП LyoPlas N-w установлено падение активности фактора VIII на 21,6% (до уровня 0,79 ± 0,12 МЕ/мл). В отличие от результатов исследования французской ЛП, изменения активности фактора V в процессе лиофилизации не отмечено, получено значение 1,07 ± 0,08 МЕ/мл. В то же время показано снижение на 25% активности фактора Виллебранда, которую не оценивали при исследовании FLyP. Структура гликопротеина до и после лиофилизации оставалась интактной, что указывает на сохранность функции первичного звена гемостаза. Остальные показатели изменялись в пределах 5,1–11,1% и соответствовали диапазону физиологической нормы. Снижение активности фактора VIII привело к пролонгации АЧТВ на 12,8%. Данные об изменении ПВ не представлены. При регидратации LyoPlas N-w в 200 мл воды для инъекций время растворения не превышает 10 мин. [20][47][48]. Значение рН регидратированного гемокомпонента 7–7,2 [10]. После восстановления гемокомпонент рекомендовано использовать в течение 6 часов. Срок годности LyoPlas N-w составляет 15 месяцев при температуре хранения от 2 до 25 °С [5][20][48]. По результатам исследования пределов сохранности LyoPlas N-w в экстремальных условиях показана стабильность гемокомпонента при кратковременном повышении температуры до 50 °С [48].

О влиянии лиофилизации на гемостатические свойства ЛП Bioplasma FDP доступна крайне ограниченная информация. Известно, что гемокомпонент имеет схожий с СЗП профиль эффективности. Этот продукт выпускается в дозах 50 и 200 мл и восстанавливается водой для инъекций. Время растворения не превышает 10 минут. Срок хранения 2 года при температуре не выше 25 °С [6–8][20].

При исследовании OctaplasLG Lyo отмечено падение активности фактора VIII на 30% в сравнении с СЗП, а также значительно меньшая, чем для FLyP и LyoPlas N-w, сохранность протеина S (снижение активности на 34%). Изменения остальных параметров коагуляционного потенциала, в том числе активности фактора V и фактора Виллебранда, находились в диапазоне от 7 до 19%. Наиболее стабильны были фибриноген, факторы X, XII, XIII и протеин С. Показатели системы гемостаза находились в пределах референсных интервалов, установленных для плазмы крови. Не отмечено значимого изменения ПВ и АЧТВ в процессе лиофилизации. Параметры тромбоэластометрии OctaplasLG Lyo сопоставимы с параметрами СЗП. Результаты оценки остальных показателей качества соответствовали требованиям спецификации: осмолярность 333–350 мОсмоль/кг; рН 7,4–7,6; содержание белка 55 мг/мл; влажность не более 1%; время растворения не более 15 мин. Поскольку производство OctaplasLG Lyo предусматривает внесение вспомогательных веществ, лимонной и фосфорной кислот, дополнительно определены концентрации ионов цитрата и фосфата 20 и 5,3 ммоль/л соответственно, что выше аналогичных показателей для СЗП (16 и 3,3 ммоль/л). Выявленные отклонения признаны допустимыми, так как подтверждено соответствие показателей качества и безопасности установленным требованиям. Содержание глицина определено на уровне 5 мг/мл. В целом сделан вывод о сопоставимости профилей качества Octaplas LG Lyo и СЗП. Срок годности гемокомпонента составляет 2 года при комнатной температуре хранения [20][24].

По результатам контроля качества опытно-промышленных серий ЛП, разрабатываемой в Республике Беларусь, установлено соответствие требованиям внутренней спецификации. Изучен коагуляционный потенциал (факторы II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, протеин С, антитромбин III и α₂-антиплазмин, ПВ, АЧТВ): активность фактора VIII — 0,82 МЕ/мл, остальных факторов свертывания крови — от 0,66 до 0,83 МЕ/мл,
естественных актикоагулянтов — от 83 до 99%, содержание фибриногена — 2,51 ± 0,25 г/л. Данные об изменении показателей в процессе лиофилизации не приведены [21].

В эксперименте in vitro при добавлении ЛП к крови пациентов с приобретенной коагулопатией показана нормализация параметров тромбоэластометрии, что свидетельствовало о потенциальной клинической эффективности гемокомпонента [22]. По результатам оценки физико-химических свойств ЛП установлено: влажность — 0,58 ± 0,3%, осмолярность — 284,1 ± 29,2 мОсмоль/кг, содержание общего белка — 53 ± 2 г/л. Показано, что содержание цитрат-ионов, кальция, натрия и калия не выходило за пределы референсных интервалов [21]. По результатам испытаний на пирогенность и аномальную токсичность ЛП была признана безопасной [22].

При изучении свойств ЛП, полученной без добавления защитных агентов (Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS, Китай), отмечено снижение активности фактора V на 19,3%, фактора VIII — на 21,4%, фактора Виллебранда — на 26,5%; несмотря на это значения показателей соответствовали физиологическим. Активность факторов II, VII, IX, X, XI, XII, плазминогена, антитромбина III, α₂-антиплазмина, протеина С и протеина S в процессе лиофилизации снижалась не более чем на 5% [25]. Для повышения коагуляционного потенциала в плазму вносили маннит в концентрации 25 г/л и регулировали рН растворителя (воды) до 7,3–7,4 фосфатно-солевым буфером (First Medical Center of PLA General Hospital, Китай). Это позволило повысить сохранность факторов V и VIII на 12 и 18% соответственно и добиться значения их активности в ЛП более 0,8 МЕ/мл. Остаточная влажность сухого гемокомпонента не превышала 2%, время восстановления водой для инъекций — 13 мин. [26].

Исследование продукта ЛП нового поколения, разработанного компанией Teleflex Inc. (США), c использованием полимерных контейнеров с мембраной продемонстрировало незначительное снижение содержания фибриногена в пределах 7%, активности фактора V — в пределах 15%, факторов VIII и Виллебранда — в пределах 10%, а также протеина С и протеина S — в пределах 9 и 7% соответственно. Падение активности остальных факторов свертывания крови не превышало 16%. Отмечали пролонгацию ПВ до 12,9 с (на 7%). Все параметры коагуляционного потенциала ЛП находились в диапазоне референсных значений. Выявленные различия не превышали порога биоэквивалентности ЛП с СЗП — 20%. Экспериментальные образцы характеризовались влажностью порядка 1%, содержанием белка — не менее 50 г/л, осмолярностью — 298,1 ± 7,2 мОсмоль/кг, рН — 6,9 ± 0,2, временем восстановления водой для инъекций — на уровне 1 мин. По результатам оценки стабильности рекомендовано хранение ЛП не более 3 лет при температуре от 2 до 8 °С и в течение нескольких месяцев при комнатной
температуре [20][30].

В процессе получения аналогичного продукта, выпускаемого в США и Канаде по технологии Terumo BCT Biotechnologies, LLC, наиболее подверженным инактивации оказался фактор VIII: его активность в процессе лиофилизации снизилась на 12,8–14,8%. Отмечено уменьшение концентрации α₂-антиплазминана на 14,3% и протеина S — на 12,1%. Изменение остальных показателей коагуляции (фибриногена, протеина С) отсутствовало или находилось в диапазоне от 2,2 до 8,7%. АЧТВ возрастал на 4,9% (до значения 29,4 ± 2,5 с), ПВ — на 4,1% (до 11,3 ± 0,7 с). В целом наблюдаемые в процессе лиофилизации изменения показателей коагуляционного потенциала не превышали 20%, поэтому гемостатические свойства ЛП посчитали сопоставимыми с СЗП. Кроме того, показано отсутствие ухудшения параметров тромбоэластометрии при сравнении ЛП с нативной плазмой. Показатели качества сухого гемокомпонента находились в пределах нормы: влажность — менее 2%, общий белок — более 50 г/л. Время растворения в воде для инъекций — в пределах 5 мин. Для регидратированного гемокомпонента измерены осмолярность 280,8 ± 12,8 мОсмоль/кг, рН 7,8 ± 0,1. По результатам анализа стабильности определен срок хранения 2 года при комнатной температуре [20][31–33].

В РФ установлены следующие требования к показателям безопасности ЛП: влажность — менее 2%, общий белок — более 50 г/л, активность фактора VIII — не менее 0,5 МЕ/мл, стерильность. Срок хранения 5 лет при температуре от 2 до 20 °С⁵. В ЛП, выпускаемой по технологии лиофилизации «Лиокон», содержание общего белка составляет 61,9 ± 3,6 г/л, активность фактора VIII — 0,56 ± 0,03МЕ/мл, концентрация фибриногена — 2,5 ± 0,2 г/л, АЧТВ — 79 ± 3 с, ПВ — 23 ± 1 с. При сравнении профиля коагуляции плазмы до и после лиофилизации установлена значительная инактивация фактора VIII — на 50% и пролонгация АЧТВ в 2,3 раза. Изменения ПВ практически не наблюдали [49]. При растворении ЛП в 250 мл 0,9%-ного физиологического раствора отмечена умеренная гиперосмолярность гемокомпонента на уровне 640 ± 22 мОсмоль/л [50]. Исследование стабильности через 3 мес. хранения в условиях жаркого климата при повышении температуры окружающей среды до 40 °С показало инактивацию фактора VIII до значения показателя 0,01 МЕ/мл и значительное снижение содержания фибриногена. В течение этого же срока при комнатной температуре 20–25 °С активность фактора VIII упала ниже нормы (0,46 ± 0,02 МЕ/мл), при хранении в холодильнике при 5 °С находилась на нижней границе регламентированного диапазона и составила 0,49 ± 0,03 МЕ/мл [51]. В настоящее время продолжаются долгосрочные испытания стабильности [50].

Представленные результаты изучения свойств ЛП свидетельствуют об актуальности разработки подходов к повышению ее коагуляционного потенциала. Для повышения стабильности ЛП возможно внесение лиопротекторов, таких как глутамин, глицин, сахароза, трегалоза, сорбит, маннит, или регуляторов рН [40][52][53]. Для компенсации показателя рН возможно добавление в нативную плазму бикарбонатного буферного раствора, лимонной или фосфорной кислот либо насыщение сухого гемокомпонента очищенным СО₂ после завершения процесса высушивания [20][24]. Показана возможность использования среды HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), которая представляет собой цвиттер-ионный органический буфер с высокой емкостью при нейтральных значениях рН (рH = 7,55) [54]. Установлено, что в присутствии HEPES активность фактора VIII в ЛП повышается на 12–18% в сравнении с ЛП, полученной без добавления стабилизаторов [12, 40]. Коррекцию водородного показателя также можно осуществлять путем восстановления ЛП водой для инъекций, подкисленной до значения рН 1,5 аскорбиновой или лимонной кислотой [5][7][20]. Некоторые авторы рекомендуют избегать применения в качестве лиопротекторов глюкозы и других восстанавливающих сахаров, которые в процессе лиофилизации могут вступать во взаимодействие со свободными аминокислотными остатками, влияя на свойства белка [52]. Следует отметить, что при внесении вспомогательных веществ в плазму должна быть тщательно доказана их безвредность. В РФ в настоящее время возможно использование только одобренных в трансфузионной практике растворов и сред⁶.

Применение лиофилизированной плазмы в экстремальных условиях

Гемокомпонент применяется при оказании медицинской помощи во многих странах. Эффективность использования ЛП для ранней трансфузионной терапии неоднократно подтверждена на практике.

FLyP использовали для оказания трансфузиологической помощи в военных операциях в Сахельском регионе Центральной Африки, Джибути, Афганистане, Ираке. Ее клиническая эффективность изучена на пациентах в отделениях интенсивной терапии в Афганистане. Данный гемокомпонент разрешен во Франции для гражданского использования в экстремальных условиях [4–8][17]. Применяли FLyP и США в специальных военных операциях в Афганистане и Ираке; с июля 2018 г. было разрешено ее экстренное использование [6][10].

LyoPlas N-w применяется в медицинских учреждениях Германии, вертолетными бригадами скорой медицинской помощи в Великобритании, Швеции, Норвегии, Финляндии, Австралии, с 2012 г. пешими патрулями в Великобритании. Доказана безопасность и эффективность ее использования на догоспитальном этапе при лечении травмированных детей [4–8]. С 2013 года Армия обороны Израиля одобрила применение ЛП LyoPlas N-w на догоспитальном этапе. В настоящее время израильские воздушные и наземные машины скорой помощи укомплектованы LyoPlas N-w [5][8][48]. Военные специалисты экстремальной медицины (врачи и фельдшеры) имеют в своих тактических жилетах по 2 комплекта ЛП группы AB(IV) [8].

С 1996 г. Bioplasma FDP используется в Южной Африке наравне с СЗП для оказания трансфузиологической помощи пациентам с кровопотерей, возникшей в результате травмы или послеродового кровотечения [6–8].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наиболее перспективными направлениями получения ЛП являются получение из карантинизированной или патогенредуцированной плазмы, причем это может быть монодонорский или пулированный гемокомпонент.

Карантинизация плазмы дает возможность обезопасить пациента от передачи гемотрансмиссивных инфекций. Однако это достаточно длительный процесс, занимающий не менее 120 суток. Патогенредукция позволяет повысить инфекционную безопасность ЛП, сократить срок ее получения для клинического применения, но может отрицательно сказываться на ее гемостатическом потенциале. С точки зрения инфекционной безопасности предпочтительнее использовать монодонорский продукт. В то же время пулирование позволяет стандартизовать гемокомпонент.

В экстремальных ситуациях особенно актуально применение ЛП групповой принадлежности АВ(IV), что исключает необходимость подбора пары «донор — реципиент». Это повышает оперативность проведения ранней трансфузионной терапии, которая играет ключевую роль при оказании экстренной медицинской помощи вне стационарных условий.

Известные в настоящее время коммерческие продукты ЛП производятся в стеклянных флаконах. Для оказания трансфузиологической помощи на догоспитальном этапе очевидны преимущества использования гемокомпонента в полимерных контейнерах. Разработки в данном направлении активно ведутся в США, Канаде, Российской Федерации. Применение мембранной технологии позволяет осуществлять полный цикл получения гемокомпонента в единой замкнутой системе с сохранением стерильности.

Массовое производство ЛП нового поколения в прочных компактных полимерных контейнерах является одним из путей бесперебойного трансфузионного обеспечения на догоспитальном этапе. Это будет способствовать повышению выживаемости раненых и пострадавших с острой кровопотерей в результате тяжелых травм в чрезвычайных ситуациях. В связи с этим для российской трансфузиологии актуально создание отечественных технологий и расходных систем для лиофилизации плазмы, разработка подходов к повышению эффективности ЛП.