Лабораторные маркеры эндотелиальной деструкции и активации гемостаза у пациентов с инсультом и COVID-19

ВВЕДЕНИЕ

Новая коронавирусная инфекция (COVID-19) — острое инфекционное заболевание, вызываемое штаммом коронавируса SARS-CoV-2. Коронавирусы изначально не обладают нейротропностью, но могут воздействовать на нервную систему и нарушать ее функции. Один из механизмов воздействия — это респираторная гипоксия, сопровождающая тяжелую коронавирусную пневмонию [1]. Другим механизмом повреждения является цитокиновый шторм, при котором происходит повышение уровня провоспалительных цитокинов и активация Т-лимфоцитов, макрофагов и эндотелиальных клеток. Увеличивается проницаемость сосудистой стенки, активируется система комплемента и увеличиваются свертывающие свойства крови [2]. Также было показано, что при COVID-19 развивается сверхэкспрессия ингибитора активатора плазминогена-1 (ИАП-1) и тромбинактивируемого ингибитора фибринолиза, что приводит к подавлению фибринолиза и еще большей склонности к гиперкоагуляции [3].

В патогенезе активации системы гемостаза описана роль антифосфолипидных антител — антител к кардиолипину и к β2-гликопротеину. Они активируют эндотелиальные клетки, моноциты, нейтрофилы и тромбоциты, что приводит к трансформации антикоагулянтной поверхности эндотелия в прокоагулянтную форму [4]. В литературе описана взаимосвязь между формированием антифосфолипидных антител в результате инфекции с развитием ишемического инсульта [5]. Эндотелиопатия, как показывает опыт множества исследователей, наблюдается у большинства пациентов. Такие маркеры состояния эндотелия, воспаления и коагуляции, как IL-6, TNF-α, VWF, тканевой фактор, ингибитор тканевого фактора, D-димер, тромбин-антитромбиновый комплекс, фактор тромбоцитов P4, тромбоглобулин, P-селектин и адгезия тромбоцитов значительно увеличиваются при COVID-19 легкой и средней степени тяжести [6].

Повреждение эндотелиальной стенки и активация системы гемостаза, вызываемые вирусом SARS-COV-2, могут быть причиной развития острых сосудистых событий, таких как геморрагический и ишемический инсульт. Причем вероятность их развития повышается у пациентов с повышенным риском сосудистых нарушений головного мозга к моменту заболевания новой коронавирусной инфекцией [7]. По данным госпитального регистра ТАРГЕТ-ВИП (г. Москва), частота ОНМК на фоне коронавирусной инфекции составила 0,8%, по данным зарубежных авторов — 2,4% [8][9]. Роль COVID-19 как фактора риска ишемического повреждения головного мозга подтверждается данными из регионального сосудистого центра ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ: в период пандемии на 2,2–6,1% увеличилось количество ишемических инсультов, при этом уменьшилась доля геморрагических инсультов и транзиторных ишемических атак [10].

Таким образом, выраженность эндотелиальной деструкции и сопровождающей ее активации системы гемостаза в сторону гиперкоагуляции у пациентов с новой коронавирусной инфекцией могут быть взаимосвязаны с развитием острого нарушения мозгового кровообращения. Ряд лабораторных маркеров, характеризующих состояние эндотелия и системы гемостаза, были исследованы при ишемическом инсульте. Так, крупный метаанализ показал, что повышение ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (ИАП-1), регулирующего интенсивность фибринолиза в плазме, связано с летальным исходом, инфарктом миокарда или острым нарушением мозгового кровообращения [11]. При этом полностью непонятно, является ИАП-1 просто маркером риска или же этиологической причиной сосудистого события [12]. Белок острой фазы α2-антиплазмин, ингибирующий главный фермент фибринолиза плазмин, во время острой ишемии усиливает повреждение головного мозга и гематоэнцефалического барьера, активируя матриксные металлопротеиназы. В экспериментах было показано, что терапевтическая инактивация α2-антиплазмина снижает микрососудистый тромбоз, ишемическое повреждение и отек головного мозга [13]. Экспрессирующаяся на эндотелии молекула межклеточной адгезии 1-го типа (Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) значительно повышается у пациентов с инсультом, отображая повреждение гематоэнцефалического барьера [11].

Эндотелиальный гликопротеин фактор Виллебранда участвует в адгезии тромбоцитов в месте повреждения сосудистой стенки. Было показано, что повышенные уровни фактора Виллебранда взаимосвязаны с развитием первичного или повторного инсульта, а также с летальным исходом при инсульте [14][15]. Маркером повреждения сосудистой стенки и активации системы гемостаза является гомоцистеин — метаболит аминокислот метионина и цистеина. Это один из наиболее изученных биомаркеров при инсульте: гипергомоцистеинемия ассоциирована с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, является предиктором степени тяжести неврологической симптоматики при инсульте и плохого функционального восстановления [16–18].

Антитела к бета-2 гликопротеину и к кардиолипину — это аутоантитела к фосфолипидам, являющиеся маркерами антифосфолипидного синдрома, основу которого составляет васкулопатия, связанная с невоспалительным и/или тромботическим поражением сосудов. В пожилом возрасте распространенность положительных антифосфолипидных антител может достигать 68% [19]. Было показано, что эти антитела могут принимать участие в патогенезе ишемического инсульта, а их уровни положительно коррелируют с риском развития инсульта [20][21].

Цель исследования — изучение роли маркеров активации системы гемостаза и повреждения сосудистой стенки в развитии острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) у пациентов с новой коронавирусной инфекцией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Всего в исследовании приняли участие 78 пациентов: 35 женщин и 43 мужчины.

Пациенты были разделены на 2 группы: в исследуемую группу вошли 38 пациентов с новой коронавирусной инфекцией и ОНМК, поступивших в ФГБУ ФЦМН ФМБА России и в ГКБ им. Е.О. Мухина г. Москвы, из них у 4 во время госпитализации развился геморрагический инсульт (ГИ), у 34 — ишемический инсульт (ИИ). Таким образом, группа пациентов с ОНМК была разделена на 2 подгруппы: пациенты с ИИ и с ГИ. Группу сравнения составили 40 пациентов с новой коронавирусной инфекцией без ОНМК, поступивших в ФГБУ ФЦМН ФМБА России.

Группа 1 (n = 38) — пациенты с новой коронавирусной инфекцией + ОНМК;

группа 1.1 (n = 4) — пациенты с новой коронавирусной инфекцией + ОНМК (ГИ);

группа 1.2 (n = 34) — пациенты с новой коронавирусной инфекцией + ОНМК (ИИ);

группа 2 (n = 40) — пациенты с новой коронавирусной инфекцией.

Средний возраст исследуемой группы пациентов с ГИ составил 70,9 ± 8,0 года; пациентов с ИИ — 72,0 ± 7,3 года; группы сравнения — 58,2 ± 16,7 года. Критериями включения пациентов в исследование были возраст старше 18 лет, обнаружение РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР, клинические признаки пневмонии (температура тела выше 38,5 °C, частота дыхания более 22 в минуту, одышка при физической нагрузке, сатурация менее 95% на воздухе), признаки пневмонии при исследовании органов грудной клетки методом компьютерной томографии. Все участники подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Среди сопутствующих заболеваний в общей выборке преобладала артериальная гипертензия (64%), хроническая сердечная недостаточность (39%), хроническая болезнь почек (25%), сахарный диабет (21%). Степень тяжести инсульта при поступлении по шкале National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) в исследуемой группе составила 10,4 ± 5,7 балла (13,8 ± 7,6 балла у пациентов с ГИ; 9,9 ± 5,3 балла у пациентов с ИИ). Распределение по патогенетическим вариантам ишемического инсульта составило: атеротромботический — 5 пациентов (14,7%), кардиоэмболический — 11 (32,4%), лакунарный — 2 (5,9%), неуточненный — 16 (47,1%).

В начале госпитализации у 52,6% пациентов тяжесть поражения легких была установлена на уровне КТ-1 (77,5% у группы сравнения; 29,4% у пациентов с ИИ; пациентов с ГИ и КТ-1 не было). При этом дыхательная недостаточность 1-й степени была выявлена у 70,5% пациентов: у 85,0% из группы сравнения; у 58,8% с ИИ, у 25,0% с ГИ. Среднее время пребывания в стационаре пациентов исследуемой группы составило 11,0 ± 4,7 дня. Больничная летальность составила 5,2% (2 пациента), она была обусловлена ишемическим инсультом, непосредственной причиной смерти явился отек мозга. При выписке медиана по Шкале реабилитационной маршрутизации (ШРМ) составила 4,0 (Q 3,0–4,3) балла, по модифицированной шкале Рэнкина — 3,0 (Q 3,0–3,3) балла. Тяжесть неврологической симптоматики по NIHSS составила 8,9 ± 7,2 балла. По сопутствующим заболеваниям и тяжести коронавирусной инфекции группы были репрезентативны.

Для исследования с учетом биологической роли были выбраны антитела к бета-2 гликопротеину, антитела к кардиолипину, ингибитор активатора плазминогена 1-го типа (ИАП-1), α2-антиплазмин, молекула межклеточной адгезии 1 типа (ICAM-1), фактор Виллебранда, гомоцистеин.

Венозную кровь в объеме 5 мл забирали в течение первых суток после госпитализации в пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем (VACUTEST KIMA, Италия). Через 30 мин после взятия крови пробирки центрифугировали 15 мин при 1500 g на центрифуге ELMI СМ-6MT, сыворотку крови аликвотировали и замораживали при –70 ºС. Далее методом иммуноферментного анализа (ИФА) в сыворотке определяли суммарные антитела к бета-2 гликопротеину (производитель Euroimmun, Германия), суммарные антитела к кардиолипину (производитель Euroimmun, Германия), ингибитор активатора плазминогена 1-го типа (ИАП-1) (производитель ABclonal, Китай), α2-антиплазмин (производитель ABclonal, Китай), молекулу межклеточной адгезии 1 типа (ICAM-1) (производитель ABclonal, Китай), фактор Виллебранда (ФВ) (производитель ABclonal, Китай), гомоцистеин (производитель ABclonal, Китай) на иммуноферментном микропланшетном автоматическом анализаторе Infinite F50 с использованием лабораторного инкубатора Shellab GI2-2, платформенного вибрационного шейкера Titramax 101 и анализатора для промывки микропланшетов HydroFlex.

Для каждого набора реагентов проводилось построение калибровочной кривой на основе измерения оптической плотности стандартных растворов. Пересчет оптической плотности в концентрацию в образцах сыворотки проводился при помощи программного обеспечения анализатора Infinite F50 с учетом данных калибровки.

Статистическую обработку данных проводили с применением пакетов программного обеспечения SPSS 25.0, Microsoft Excel 2016. Описательная статистика непрерывных количественных данных после анализа нормальности распределения представлена в виде среднего значения (M) и стандартного отклонения при нормальном распределении или в виде медианы (Md) и значений 25% нижнего и 75% верхнего квартилей с использованием знака Q [25–75%] при ненормальном распределении. Нормальным принималось распределение, у которого критерий отличия типа Колмогорова — Смирнова от теоретически нормального распределения был более 0,05. Аналитическая статистика выполнялась с помощью t-теста Стьюдента для количественных данных с нормальным распределением или критерия суммы рангов/знаков Уилкоксона, Манна — Уитни для количественных данных с распределением, отличным от нормального. Значение вероятности р ≤ 0,05 демонстрировало статистическую значимость.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка нормальности распределения значений лабораторных маркеров показала, что большая часть маркеров не обладала нормальным распределением по совокупности факторов, вследствие чего были использованы непараметрические методы анализа. Также ограничения на выбор статистических методов были связаны с небольшим числом пациентов в подгруппе с ГИ. Следует отметить, что в задачи исследования не входил расчет референтных интервалов, которые производители реагентов предлагают рассчитывать каждой лаборатории самостоятельно посредством собственной выборки. Результаты измерения лабораторных показателей представлены в таблице.

По уровню антифосфолипидных антител не было выявлено статистически значимых различий между группами. При этом в исследуемой группе с ОНМК полностью отсутствовали (не определялись методом ИФА) антитела к бета-2 гликопротеину у 16 пациентов (42%), антитела к кардиолипину — у 34 (89%). В группе сравнения у 12 (30%) пациентов не определялись антитела к бета-2 гликопротеину и у 32 (80%) — антитела к кардиолипину. У 10 (26%) пациентов из группы ОНМК и у 15 (38%) из группы сравнения концентрация антител к бета-2 гликопротеину была выше референтного интервала, указанного в инструкции к набору (10 ОЕ/мл), то есть повышенные концентрации чаще наблюдались в группе сравнения. Повышенные относительно референтного интервала концентрации антител к кардиолипину (более 10 ОЕ/мл) встречались намного реже: у 1 (2,6%) пациента из группы ОНМК и у 1 (2,5%) пациента из группы сравнения. Бета-2-гликопротеин является сывороточным кофактором, он обладает антикоагулянтной активностью in vivo, а антитела к нему, помимо непосредственного подавления активности, индуцируют экспрессию Е-селектина на мембране эндотелиальных клеток и секрецию провоспалительных цитокинов и простагландина Е2, что может приводить к повреждению эндотелия и активации системы гемостаза в сторону гиперкоагуляции¹. Однократно измеренное повышение концентрации антифосфолипидных антител у части пациентов еще не говорит о развитии антифосфолипидного синдрома, но подтверждает данные других авторов о том, что появление антифосфолипидных антител связано именно с вирусной инфекцией, вызванной SARS-CoV-2 [22].

По уровню ИАП-1 были выявлены статистически значимые различия между группой с ОНМК и группой сравнения (p < 0,001) и между группой с ИИ и группой сравнения (p < 0,001), причем в группе сравнения концентрация ИАП-1 была в 1,6 раза выше, чем у пациентов с ОНМК. Возможно, более низкие уровни ИАП-1 в группе ОНМК обусловлены активацией процессов фибринолиза, которые запускаются после тромботического сосудистого события, и подавлением антифибринолитической активности крови.

По уровню α2-антиплазмина, ICAM-1 и фактора Виллебранда статистически значимых различий между группами выявлено не было. При этом обращает на себя внимание тенденция к более высокому уровню эндотелиальной молекулы ICAM-1 у пациентов с ОНМК, что может быть вызвано повреждением гематоэнцефалического барьера вследствие инсульта.

Неожиданными оказались результаты измерения гомоцистеина в исследуемых группах. Так как для определения концентрации гомоцистеина использовались единицы измерения из инструкции к набору — нг/мл, а сам набор был предназначен строго для научного использования, мы не стали сравнивать уровень гомоцистеина в исследуемых группах с общепринятым пороговым уровнем² 11,4 мкмоль/л, расчет же собственного референтного интервала не входил в задачи нашего исследования. Статистически значимые различия были выявлены между группой с ОНМК и группой сравнения (p < 0,001), группой с ИИ и группой сравнения (p < 0,001), а также между группой с ГИ и группой сравнения (p < 0,05), причем концентрация в группе сравнения была в 1,8 раза выше, чем в группе с ОНМК, несмотря на то что концентрация гомоцистеина имеет тенденцию к повышению с возрастом из-за снижения экскреторной функции почек, а возраст пациентов с ОНМК был выше, чем в группе сравнения. Мы ожидали получить противоположные результаты, с учетом повреждающего воздействия гомоцистеина на эндотелиальные клетки, его подавляющего действия на естественный антикоагулянт антитромбин III, прямого нейротоксического действия на нейроны головного мозга [23] и, следовательно, создания предпосылок для развития сосудистых событий. Однако полученные результаты заставляют по-новому взглянуть на патогенез ОНМК при коронавирусной инфекции.

Таким образом, полученные результаты подтверждают данные о том, что коронавирус может индуцировать образование антифосфолипидных аутоантител, которые были обнаружены более чем у половины исследованных пациентов. Такие пациенты подлежат дальнейшему наблюдению и обследованию на предмет исключения развития антифосфолипидного синдрома и тромботических осложнений. Подавление антифибринолитического звена у пациентов с ОНМК, проявляющееся снижением концентрации ИАП-1, может быть следствием компенсаторного усиления фибринолиза в ответ на тромботическое событие, приведшее к инсульту. Более высокие уровни гомоцистеина у пациентов с коронавирусной инфекцией без ОНМК, вероятно, говорят об исходно более высоком протекторном потенциале эндотелиальной стенки и системы гемостаза, что снижает у таких пациентов риск развития ОНМК, однако данное предположение требует проведения дальнейших исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие ОНМК у пациентов с более низкими концентрациями гомоцистеина и ИАП-1, вероятно, можно объяснить более слабыми компенсаторными механизмами, направленными на репарацию сосудистой стенки и гармонизацию взаимодействия звеньев системы гемостаза, что в конечном счете приводит к повреждению сосудистой стенки. Более точное понимание молекулярных механизмов возникновения инсульта при коронавирусной инфекции будет возможно при расширении панели лабораторных биомаркеров и увеличении выборки пациентов. Изучение механизма образования антифосфолипидных антител на фоне коронавирусной инфекции также, несомненно, является актуальной задачей в свете предотвращения тромботических осложнений.