Современный подход к дифференциальной диагностике бета-герпесвирусной инфекции человека 6А/В у детей

ВВЕДЕНИЕ

Герпесвирусные инфекции являются важной проблемой современности ввиду повсеместной распространенности, высокого уровня инфицированности населения, возможности реактивации при развитии иммунодефицитных состояний с высоким риском неблагоприятного исхода [1–3]. В последние годы особое внимание герпесвирусам уделяется по причине роста случаев активной герпесвирусной инфекции, вызванной в том числе бета-герпесвирусами человека 6А/В, у людей, перенесших острую респираторную инфекцию, вызываемую коронавирусом SARS-CoV-2 (COVID-19) [4–6], а также у детей с рекуррентными респираторными заболеваниями (РРЗ). Бета-герпесвирус человека 6А/В (ВГЧ-6А/В) впервые был обнаружен в 1985 году у иммунокомпрометированных пациентов [7], однако в настоящее время известно, что вирус является одним из наиболее распространенных герпесвирусов — уровень серопозитивных лиц к ВГЧ-6А, ВГЧ-6В или к обоим видам у взрослого населения достигает 95% [8]. Как и другие представители семейства, ВГЧ-6А/В характеризуется полиморфизмом клинических проявлений, является триггером аутоиммунных, лимфопролиферативных заболеваний [9–13].

Высокий уровень инфицированности ВГЧ-6А/В приводит к частому обнаружению маркеров бета-герпесвирусной ВГЧ-6А/В инфекции, трудностям дифференциальной диагностики (ДД) активной и латентной форм, особенно у детей с лимфопролиферативным и катаральным синдромами, а также РРЗ, к гипердиагностике активных форм инфекции и последующему назначению иммунотропной терапии с противовирусной целью [8][14–16].

Цель исследования — предложить современный способ ДД активной и латентной форм ВГЧ-6А/В инфекции у детей для оптимизации тактики ведения пациентов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование, выполненное на базе ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России с 2021 по 2023 г., были включены 152 пациента в возрасте от 1 месяца до 17 лет 11 месяцев 29 дней, из них 112 детей составили тренировочную выборку для обучения классификатора, а 40 — тестовую выборку для валидации работы классификатора. Критерии включения для тренировочной выборки: выявление ДНК ВГЧ-6А/В в цельной крови методом качественной ПЦР с последующей оценкой уровней пороговых циклов амплификации (сycle threshold, Ct). Критерии невключения: несогласие законных представителей пациентов на участие в исследовании; тяжелые соматические заболевания в стадии декомпенсации; обнаружение РНК SARS-CoV-2 в отделяемом верхних дыхательных путей методом ПЦР.

Пациенты были госпитализированы в круглосуточный или дневной стационар в зависимости от тяжести состояния. При поступлении проводился сбор анамнестических данных, в том числе проанализированы данные медицинской документации амбулаторного этапа (история развития ребенка — форма № 112/у или выписка из нее). При осмотре особое внимание уделялось оценке наличия и выраженности лимфопролиферативного синдрома, характерного для герпесвирусной инфекции, а именно: аденоидита, тонзиллита, лимфаденопатии, гепатоспленомегалии.

В первые сутки госпитализации выполнялись клинический и биохимический анализы крови с оценкой уровня СРБ. Для интерпретации результатов лабораторного обследования применялись референсные значения производителей тест-систем с учетом возрастных особенностей. Всем пациентам проведено исследование цельной крови методом качественной ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК ВГЧ-6А/В с оценкой уровня Ct (наборы «АмплиСенс EBV/CMV/HHV6-скрин-FL», ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Ct представляет собой значение, при котором пороговая линия пересекает S-образные кривые накопления сигнала в опытных образцах и контрольных пробах. Этот показатель указывает на количество циклов амплификации, необходимых для начала обнаружения ДНК вируса в образце. Низкое значение Ct указывает на высокую концентрацию вируса и на значительное количество выделенной вирусной ДНК в пробе, что свидетельствует о высокой вирусной нагрузке. В то время как высокие значения Ct указывают на низкую вирусную нагрузку [17].

Статистическая обработка проведена с использованием модулей Microsoft Excel, пакета программ StatSoftStatistica 7.0. При использовании тренировочной выборки строилась модель зависимости принадлежности пациента к одной из двух групп, основанная на значении факторов в различных комбинациях, где 1 — латентная форма ВГЧ-6А/В инфекции (n = 89), 2 — активная форма ВГЧ-6А/В инфекции (n = 23). В группу активной инфекции взяты дети с внезапной экзантемой, вызванной лабораторно подтвержденным ВГЧ-6А/В [18–20]. В качестве потенциальных предикторов в исходной обучающей модели рассматривалось 27 анамнестических, клинических и параклинических признаков. Построение дискриминантной модели выполнялось методом пошагового включения предикторов с использованием F-критерия Фишера (значение критерия F — 4,0, нижняя граница толерантности — 0,01). При всех видах статистического анализа использовался уровень значимости p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С целью улучшения точности и своевременности диагностики на основе комплексного клинико-лабораторного обследования, включающего ПЦР-исследование, была разработана прогностическая модель с применением дискриминантного анализа. Из 27 изученных признаков было выделено 4 параметра, которые продемонстрировали наибольшие статистически значимые различия между группами — p < 0,001 (табл. 1).

В результате была получена модель ДД латентной и активной форм ВГЧ-6А/В инфекции у детей, которая продемонстрировала высокую статистическую значимость (p < 0,001) и способность к классификации на уровне 93,75%. Модель учитывает такие параметры, как степень выраженности лихорадки, наличие кашля, абсолютное количество нейтрофилов и уровень Ct ДНК ВГЧ-6А/В, и обладает высокой чувствительностью (91,3%) и специфичностью (94,4%).

Диагностика осуществляется следующим образом. При обращении за медицинской помощью ребенка с подозрением на активную форму ВГЧ-6А/В инфекции (лихорадка, катаральный и лимфопролиферативный синдромы, клинические проявления инфекционного мононуклеоза, наличие РРЗ) проводят клинический анализ крови на автоматизированном гематологическом анализаторе с оценкой абсолютного значения нейтрофилов, исследование цельной крови методом ПЦР с определением Ct ДНК ВГЧ-6А/В. Полученные данные предикторных признаков используют для расчетов по формулам (1), (2) линейной дискриминантной функции (ЛДФ):

ЛДФ1 (латентная форма ВГЧ-6А/В инфекции): (1)

42,7×Х1 – 49,2×Х2 – 6,2×Х3 + 5,2×Х4 – 865,

ЛДФ2 (активная форма ВГЧ-6А/В инфекции): (2)

45,1×Х1 – 53×Х2 – 6,7×Х3 + 4,7×Х4 – 940,

где Х1 — максимальная выраженность лихорадки, °С;

Х2 — наличие кашля: нет — 0, есть — 1;

Х3 — абсолютное количество нейтрофилов, ×10⁹/л;

Х4 — пороговые циклы амплификации ДНК ВГЧ-6А/В.

Сравнивают полученные значения ЛДФ1 и ЛДФ2: если ЛДФ1 больше ЛДФ2, диагностируют латентную форму ВГЧ-6А/В инфекции, при ЛДФ2 больше ЛДФ1 — активную.

Выполнена классификация тестовой выборки (n = 40). Дискриминантный анализ позволил успешно выявить 8 из 10 случаев активной формы ВГЧ-6А/В инфекции и 29 из 30 случаев латентной. Суммарный процент верных диагнозов составил 92,5%, что сопоставимо с результатами на тренировочной выборке. Получен патент на изобретение № 2817089 от 09.04.2024 [21].

Для лучшего понимания работы предложенной модели приводим собственное клиническое наблюдение.

Клинический случай

Девочка Ксения, 8 лет 2 мес., поступила в ДНКЦИБ планово в связи с РРЗ, сопровождающимися фебрильной лихорадкой, для обследования и подбора терапии. В анамнезе у ребенка болезнь Шинца, атопический дерматит. Эпидемиологический анамнез не отягощен. При поступлении состояние удовлетворительное, температура тела в пределах нормы (значение предиктора Х1 — «36,5»). Кожные покровы обычной окраски, влажности, без инфекционной сыпи. Ринит, кашель отсутствовали (значение предиктора Х2 — «0»). Зев спокойный, миндалины не увеличены, налетов нет. Периферические лимфоузлы не увеличены. Тоны сердца ясные, ритмичные. Дыхание везикулярное, проводится во все отделы легких, хрипы не выслушиваются. Живот мягкий, безболезненный, печень, селезенка не увеличены. Диурез сохранен. В клиническом анализе крови все показатели в пределах референсных значений (значение предиктора Х3 (абсолютное количество нейтрофилов) — «3,35»). В общем анализе мочи не выявлено воспалительных изменений. В посевах отделяемого из носо- и ротоглотки на микрофлору отмечался рост нормобиоты. Учитывая анамнестические данные, для исключения реактивации герпесвирусов выполнена качественная ПЦР цельной крови на ДНК ВГЧ-6А/В, вируса Эпштейна — Барр и цитомегаловируса методом ПЦР: обнаружены ДНК ВГЧ-6А/В, значение Ct (предиктор Х4) — 31. При исследовании крови методом ИФА на специфические антитела класса IgM, IgG к герпесвирусам получены следующие результаты: обнаружены IgG к цитомегаловирусу (ЦМВ). Антитела IgM к ЦМВ, IgG к ядерному и капсидному антигенам ВЭБ, ВГЧ-6А/В не выявлены. Учитывая положительный результат ПЦР на ДНК ВГЧ-6А/В, заключительный клинический диагноз трактовался как персистирующая ВГЧ-6А/В инфекция в стадии активации. Ребенку была назначена иммунотропная терапия с противовирусным действием — меглюмина акридонацетат по инструкции производителя, курс 23 дня.

Ретроспективно выполнен расчет по формулам:

ЛДФ1 = 42,7×36,5 – 49,2×0 – 6,2×3,35 + 5,2×31 – 865 = 834,98

ЛДФ2 = 45,1×36,5 – 53×0 – 6,7×3,35 + 4,7×31 – 940 = 829,41

ЛДФ1 > ЛДФ2, с вероятностью 94,4% имела место латентная форма ВГЧ-6А/В инфекции.

Данный пример демонстрирует, что, согласно предложенной дискриминантной модели, вероятность активной формы ВГЧ-6А/В инфекции была крайне низка (5,6%) и при использовании данной модели возможно было избежать длительного курса иммунотропной терапии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существующая проблема гипердиагностики активной формы ВГЧ-6А/В инфекции связана с интерпретацией результатов качественной ПЦР цельной крови без учета возможной латенции вируса в мононуклеарных клетках. Обнаружение ДНК ВГЧ-6А/В приводит к назначению длительных повторных курсов иммунотропной терапии, несмотря на их необоснованность в большинстве случаев. Для решения проблемы ДД активной и латентной форм ВГЧ-6А/В инфекции у детей с лимфопролиферативным и респираторным синдромами нами была разработана прогностическая модель с использованием дискриминантного анализа, основанная на комплексной оценке клинико-лабораторных показателей.

О.В. Уткиным и соавт. предложен способ идентификации инфекционного мононуклеоза, ассоциированного с бета-герпесвирусом человека 6А/В. В изобретении учитываются такие биомаркеры, как мРНК AVEN, транскрипт 2 CHUK, транскрипт 2 CIRBP, транскрипт 2 TRAF3 и транскрипт 10 IRAK4. Метод крайне интересен с точки зрения изучения молекулярных механизмов патогенеза, однако его недостатками являются оценка активности инфекции в отношении только одной нозологической формы (инфекционный мононуклеоз), недоступность реализации в практическом здравоохранении при большом потоке пациентов, отсутствие необходимой для изучения генов и транскриптов технической оснащенности лабораторий и обученного персонала, высокие финансовые затраты, сложность в интерпретации полученных результатов [22].

Е.В. Мелехина и соавт. для решения данной проблемы разработали способ определения показаний к проведению противогерпетической терапии при инфекции ВГЧ-6А/В у детей с острыми респираторными заболеваниями. Активная форма инфекции, требующая назначения противовирусной терапии, устанавливается при обнаружении в крови более 100 копий ДНК ВГЧ-6А/В/10⁵ клеток методом количественной ПЦР. Предложенный способ характеризуется быстротой выполнения, адекватным подходом к полученным результатам, учитывающим разный уровень вирусной нагрузки, удобством при наличии количественной ПЦР, которая, однако, не является доступным методом диагностики на всех уровнях оказания медицинской помощи [23].

Возможно использование ПЦР с обратной транскрипцией для дифференциации активной и латентной форм ВГЧ-6А/В инфекции. Метод характеризуется более высокими показателями чувствительности и специфичности, чем культуральные исследования. Установление формы инфекции зависит от обнаруженных матричных РНК вирусных белков: открытые рамки считывания U42, U22, U38, U100 свидетельствуют об активной форме инфекции, а U94, напротив, — о латентной [20]. Метод является перспективным, однако недоступным в настоящее время на практике.

Предложенная нами модель обладает такими преимуществами, как простота, доступность, быстрота выполнения, возможность ДД активной и латентной форм ВГЧ-6А/В инфекции без использования дополнительных финансовых затрат на дорогостоящие лабораторные исследования. Уникальность метода подтверждена патентом на изобретение.

ВЫВОДЫ

Разработанная прогностическая модель может быть применена в клинической практике для ДД активной и латентной форм ВГЧ-6А/В инфекции у детей с катаральным, лимфопролиферативным синдромами при обнаружении ДНК ВГЧ-6А/В в цельной крови, а также для обоснования назначения иммунотропной терапии с противовирусным действием. При установлении латентной формы ВГЧ-6А/В инфекции необходимо провести дальнейший диагностический поиск для исключения аутовоспалительных заболеваний или другой инфекционной патологии, сопровождающейся соответствующим симптомокомплексом, при активной форме — исключать инфекционный мононуклеоз моно- и сочетанной герпесвирусной этиологии, а также ассоциированные с вирусной инфекцией поражения органов и систем.