Роль регуляторных Т-лимфоцитов в формировании иммуносупрессивного микроокружения при глиобластоме

ВВЕДЕНИЕ

Глиобластома — самая распространенная и агрессивная опухоль головного мозга, характеризующаяся крайне высокой летальностью. В среднем медиана выживаемости пациентов составляет 13,5 месяца, а общая пятилетняя выживаемость — около 5,8% [1].

В соответствии с классификацией ВОЗ 2021 года глиобластома относится к диффузным глиомам IV степени злокачественности (Grade IV). Дифференцируют первичную форму глиобластомы, возникающую de novo, и вторичную, которая развивается в результате прогрессирования глиом более низкой степени злокачественности (Grade II и III). При этом первичный тип встречается чаще (до 90% от общего числа случаев), отличается высокой инвазивностью и стремительным развитием [2].

К факторам, которые могут провоцировать развитие злокачественных глиом головного мозга, относят генетические аберрации, вирусные инфекции (цитомегаловирус, герпес и др.) и ионизирующее излучение, а также наличие в анамнезе синдрома Туркота, нейрофиброматоза I и II типа или туберозного склероза [3]. При этом с возрастом риск развития заболевания повышается вследствие снижения эффективности процессов репарации ДНК и ослабления иммунного ответа [4].

В качестве стандартного лечения пациентов с глиобластомой применяется хирургическая резекция опухоли, радиотерапия и химиотерапия темозоломидом. Хирургическое вмешательство осложняется тем, что для глиобластомы характерен инвазивный рост, препятствующий полному иссечению патологической ткани, что впоследствии может приводить к рецидивам заболевания. Прогноз для каждого отдельно взятого пациента индивидуален и зависит от многих факторов (локализации новообразования, подтипа опухоли, времени постановки диагноза и начала терапии и т. д.). Химио- и радиотерапия во многих случаях сопровождается формированием резистентности [5]. Таким образом, стандартная терапия, используемая в настоящее время, является недостаточно эффективной, обладает рядом негативных побочных эффектов и нередко приводит к рецидивам [6]. При этом в случае повторного возникновения опухоль зачастую имеет более агрессивный характер течения и повышенную терапевтическую резистентность [7].

Сравнительно высокая устойчивость глиобластомы к разным видам терапии вызвана гетерогенностью опухоли и иммуносупрессивным микроокружением [8]. Поэтому остро стоит вопрос разработки новых методов лечения, учитывающих особенности, характерные для глиобластомы. В этом отношении большим потенциалом обладает иммунотерапия [9]. Посредством данного терапевтического подхода возможно напрямую или опосредованно модулировать иммунный ответ, стимулируя естественный противоопухолевый иммунитет пациента и снижая выраженную иммуносупрессию в очаге глиомы для повышения эффективности других видов лечения в составе комбинированной терапии.

Цель исследования — анализ механизмов функционирования регуляторных T-лимфоцитов (Treg) в микроокружении опухоли как потенциальной мишени для терапии, а также выявление перспективных терапевтических методов, используемых для снижения супрессорного действия регуляторных T-лимфоцитов при глиобластоме.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поиск литературы осуществлялся в базах данных PubMed, Google Academy и eLibrary по ключевым словам «глиобластома», «глиома», «регуляторные T-лимфоциты», «иммуносупрессия», «микроокружение» и «иммунотерапия». Преимущественно приведены исследования, опубликованные за последние 5 лет.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Иммуносупрессивное микроокружение при глиобластоме

По мере развития глиобластомы происходит формирование опухолевого микроокружения (tumor microenvironment, TME), играющего важную роль в инициировании неоваскуляризации, прогрессии, инвазии и метастазировании глиомы [10]. В результате этого процесса образуется сложная гетерогенная система, состоящая из собственно опухолевых клеток, а также экстрацеллюлярного матрикса, фибробластов, эндотелиоцитов, перицитов, иммунных клеток и выделяемых этими клетками сигнальных молекул [11]. По данным M. Dinevska et al., компоненты TME взаимодействуют друг с другом и опухолевыми клетками посредством межклеточных контактов и секреции различных цитокинов, хемокинов и факторов роста [12].

R.Qiu, Y.Zhong et al. отмечают, что глиобластома значительно влияет на иммунные клетки и моделирует их фенотип, секретируя целый спектр биологически активных молекул [13]. В свою очередь, иммунные клетки микроокружения поддерживают высокий уровень иммуносупрессии в микросреде глиомы, что способствует опухолевой прогрессии.

В очаге глиобластомы присутствуют иммунные клетки, функцией которых является воспаление и противоопухолевый ответ: цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ), натуральные киллеры, T-хелперы, дендритные клетки, B-лимфоциты, нейтрофилы, моноциты и М-1-поляризованные макрофаги. Инфильтрация опухоли эффекторными клетками имеет положительное прогностическое значение при глиобластоме [14]. Но зачастую клетки, присутствующие в TME, характеризуются сниженной противоопухолевой активностью или приобретают проопухолевый фенотип под воздействием глиомы.

Микроокружение, сформированное под влиянием глиобластомы, способствует успешному ускользанию опухоли от иммунологического надзора, приводя к подавлению активации и пролиферации цитотоксических T-лимфоцитов и NK-клеток, B-лимфоцитов, нарушению презентации опухолевых антигенов на главном комплексе гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) дендритных клеток и привлечению в микроокружение регуляторных T-клеток [15]. Отсутствие достаточного уровня презентации антигенов, ассоциированных с глиобластомой, закономерно ведет к низкой эффективности адаптивного иммунного ответа.

Клетки, главным образом обеспечивающие иммуносупрессию в опухолевом микроокружении, — опухоль-ассоциированные макрофаги (tumor-associated macrophages, TAMs), супрессорные клетки миелоидного происхождения (myeloid-derived suppressor cell, MDSCs) и регуляторные T-лимфоциты (regulatory T cells, Treg) [16][17].

Опухоль-ассоциированные макрофаги, включающие в себя микроглию головного мозга и макрофаги периферического происхождения, являются наиболее многочисленными неопухолевыми популяциями в микроокружении опухоли при глиобластоме. Популяция макрофагов обладает пластичностью: клетки могут поляризоваться как в провоспалительный, так и в противовоспалительный фенотип [18].

Супрессорные клетки миелоидного происхождения представляют собой гетерогенную популяцию миелоидных клеток-предшественников на разных стадиях дифференцировки, которые вызывают ингибирование активности цитотоксических T-лимфоцитов, подавление функции NK-клеток, макрофагов и дендритных клеток, а также индукцию регуляторных T- и B-лимфоцитов в опухолевом микроокружении [19].

Регуляторные T-лимфоциты — основная популяция клеток, с одной стороны, поддерживающая гомеостаз иммунной системы, с другой стороны, играющая ключевую роль в ускользании глиобластомы от иммунного ответа. Таким образом, регуляторные T-клетки представляют интерес в качестве мишени для терапии злокачественных глиом, но неселективное воздействие на популяцию Treg сопряжено со многими побочными эффектами.

В микроокружении глиобластомы MDSC, TAM и Treg вступают в синергию, дополняя и усиливая проопухолевые эффекты друг друга. Регуляторные T-лимфоциты стимулируют поляризацию опухоль-ассоциированных макрофагов, а TAM, в свою очередь, поддерживают супрессивную активность Treg [20]. Также Treg усиливают экспансию и ингибиторную функцию супрессорных клеток миелоидного происхождения; MDSC же способствуют пролиферации и индукции регуляторных T-клеток [21].

Авторы M. Iglesias-Escudero, N. Arias-González et al. сообщают о регуляторных B-лимфоцитах и регуляторных NK-клетках как о компонентах иммуносупрессивного микроокружения [22]. Регуляторные B-клетки осуществляют функции иммунорегуляции посредством секреции цитокинов и межклеточных контактов. В опухолевом микроокружении регуляторные B-клетки ингибируют эффекторные T-лимфоциты, индуцируя активацию Treg и воздействуя на другие клетки, инфильтрирующие TME, такие как MDSC, NK-клетки и макрофаги [23]. NK-клетки в микроокружении опухоли могут выполнять регуляторную функцию, оказывая влияние на созревание дендритных клеток и приводя к снижению активации ЦТЛ [24].

Популяция регуляторных T-лимфоцитов

Регуляторные T-клетки представляют собой субпопуляцию CD4⁺ T-лимфоцитов и выполняют функции контроля продолжительности иммунного ответа и поддержания доминантной иммунологической толерантности к собственным антигенам. Нарушение нормального функционирования Treg играет важную роль в патогенезе реакции «трансплантат против хозяина», аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний [25].

Регуляторные T-лимфоциты имеют достаточно широкий репертуар специфичностей T-клеточных рецепторов (T-cell receptor, TCR) и преимущественно распознают собственные пептиды. Большая часть Treg образуется в тимусе как функционально зрелые T-лимфоциты (естественные Treg), а меньшая часть — индуцируется из наивных T-клеток после антиген-зависимой дифференцировки на периферии (адаптивные Treg) [26]. Популяция естественных регуляторных T-лимфоцитов обеспечивает толерантность к аутоантигенам, в то время как адаптивные Treg ограничивают воспаление при инфекции и подавляют патологический иммунный ответ, связанный с трансплантацией и аллергическими состояниями.

Популяция Treg высоко гетерогенна: экспрессия многих мембранных и внутриклеточных маркеров этих клеток, включая FOXP3 и CD25, значительно варьирует в зависимости от ряда факторов, в том числе от функционального состояния клеток, тканевой локализации, наличия патологии и присутствия в среде цитокинов [27].

Маркеры CD3, CD4, CD25, CD127 и FOXP3 являются основными необходимыми маркерами для определения Treg-клеток человека. Окрашивание на Ki67 и CD45RA дает дополнительную информацию о статусе активации Treg. Каждый из маркеров регуляторных T-лимфоцитов несет свое функциональное значение и необходим для корректной работы клеток:

• мультипротеиновый комплекс CD3 представляет собой основной корецептор T-клеточного рецептора и экспрессируется на поверхности мембраны всех субпопуляций T-лимфоцитов;
• трансмембранный гликопротеин надсемейства иммуноглобулинов CD4 играет роль корецептора αβ-TCR, принимая участие в распознавании представляемого антигенпрезентирующими клетками антигена;
• протеин CD25 является альфа-субъединицей низкоаффинного рецептора к противовоспалительному цитокину IL-2 и обнаруживается на Treg, а также на активированных B-клетках, NK-клетках, миелоидных предшественниках и олигодендроцитах;
• транскрипционный фактор forkhead box protein P3, или скурфин (FOXP3), является специфическим белком для активированных CD4⁺CD25⁺ Стабильная экспрессия FOXP3 необходима для регуляции дифференцировки и функций регуляторных T-лимфоцитов. Дефекты в гене FOXP3 приводят к дефициту или отсутствию нормально функционирующих Treg. Но также FOXP3 имеет важное значение для функционирования Treg и в опухолевом микроокружении [28];
• CD127 представляет собой альфа-цепь рецептора IL-7. Было выявлено, что для регуляторных T-клеток его экспрессия обратно пропорциональна экспрессии FOXP3, поэтому CD127 используется в качестве отрицательного маркера Treg.

Среди CD4⁺CD25⁺ лимфоцитов выделяют клетки со стабильной и нестабильной экспрессией транскрипционного фактора FOXP3. При этом клетки, не экспрессирующие FOXP3, не проявляют супрессорных свойств. Было отмечено, что для некоторого процента общей популяции Treg существует возможность трансформации Treg/Tconv [29], то есть клеток, обладающих супрессорными эффектами, и нерегуляторными T-хелперами.

Роль регуляторных T-клеток в опухолевом микроокружении

Регуляторные T-лимфоциты, функционирование которых необходимо для поддержания адекватного уровня иммунного ответа, являются также важным компонентом опухолевого микроокружения. Treg проявляют значительную пластичность и функциональное разнообразие в различных опухолях в пределах микроокружения [30].

Долгое время головной мозг считался органом, изолированным от периферической иммунной системы, но в настоящий момент все чаще признается вовлеченным в структуру системного иммунитета. Интеграция и взаимодействие мозга с компонентами периферического иммунитета требуют строгого контроля и тонкой регуляции. Ключевой популяцией, обеспечивающей дополнительные механизмы иммунорегуляции в мозге, являются регуляторные T-лимфоциты [31]. Но в случае развития злокачественных новообразований Treg могут способствовать развитию опухоли и ее ускользанию от иммунного надзора. На поздних стадиях развития высокозлокачественных глиом часто происходит повреждение гематоэнцефалического барьера, что дополнительно способствует миграции Treg и других иммунных клеток в периопухолевое пространство [32].

Опухоли, и в частности глиомы, поддерживают высокий уровень иммуносупрессии в микроокружении за счет инфильтрации регуляторными клетками. Авторами L.G. Richardson et al. отмечено, что при IDH-мутантной глиоме инфильтрация TME Treg менее выражена по сравнению с более агрессивной глиобластомой IDH-дикого типа [33]. В очаге опухоли накапливается большое количество Treg посредством селективного, опосредованного хемокинами, рекрутирования периферических T-лимфоцитов. Отмечено, что Treg у пациентов с глиобластомой имеют значительно более высокие уровни экспрессии рецептора CCL2 CCR4, чем Treg у здоровых людей [34]. Помимо привлечения периферических регуляторных T-клеток, опухоли стимулируют приобретение регуляторного фенотипа наивными CD4⁺ T-клетками [35]. Было установлено, что кондиционированная среда глиобластомы может способствовать экспансии Treg in vitro, что указывает на прямое влияние факторов, продуцируемых клетками опухоли, на регуляторные T-лимфоциты [36].

Регуляторные T-лимфоциты оказывают иммуносупрессивное действие в опухолевом микроокружении за счет нескольких основных механизмов (рис. 1).

Регуляторные T-клетки вырабатывают гранзим В и перфорин, воздействуя на эффекторные клетки и стимулируя их апоптоз.

• Treg секретируют ингибирующие цитокины TGF-β, IL-10, и IL-35, которые подавляют активность ЦТЛ, связываясь с рецепторами на поверхности CD8⁺клеток.
• Цитотоксический Т-лимфоцитарный белок 4 (CTLA-4) на мембране регуляторных T-лимфоцитов конкурирует с CD80/CD86 на поверхности T-киллеров, что приводит к подавлению их активности и способствует секреции индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO); IDO активирует сигнальные пути апоптоза эффекторных T-клеток. Также взаимодействие CTLA-4 и LAG-3 с CD80/CD86 и MHC-II на поверхности дендритных клеток приводит к подавлению их созревания и снижению эффективной презентации антигенов.
• ICOS (индуцируемый костимулятор T-лимфоцитов) на поверхности Treg связывается с ICOSL (лиганд индуцируемого костимулятора) на мембране эффекторных клеток, стимулируя выработку противовоспалительного цитокина IL-10.
• Эктонуклеотидазы CD39/CD73 на мембране Treg превращают АТФ в аденозин, связывающийся с рецепторами ЦТЛ, что приводит к снижению их функциональной активности.

Ускользание глиобластомы от противоопухолевого иммунитета регуляторные Т-клетки обеспечивают главным образом за счет ингибирования CD8⁺ цитотоксических лимфоцитов и снижения функциональной активности NK-клеток посредством межклеточных взаимодействий и секреции растворимых факторов [38]. Помимо этого, за счет выработки TGF-β и IDO и снижения секреции IL-2 и IFN-γ регуляторные T-лимфоциты могут подавлять антигенпрезентирующие клетки и повышать активность TAM и MDSC, что вносит существенный вклад в поддержание иммуносупрессивной микросреды в очаге глиомы. Также было отмечено, что транскрипционный фактор FOXP3 может индуцировать экспрессию гем-оксигеназы HO-1, что приводит к экспансии и повышению выживаемости популяции Treg, а также к снижению экспрессии провоспалительных цитокинов и подавлению пролиферации эффекторных T-лимфоцитов [39]. В дополнение к этому регуляторные T-клетки могут вызывать репликативное старение и гибель эффекторных CD4⁺ T-лимфоцитов, ЦТЛ, B-лимфоцитов и NK-клеток in vitro и in vivo [40].

TGF-β, секретируемый регуляторными T-лимфоцитами, не только участвует в поддержании иммуносупрессии, но и действует на опухолевые клетки, индуцируя экспрессию основных генов, связанных со стволовыми клетками глиомы (CD133, SOX2, NESTIN, MUSASHI1 и ALDH1A), а также сигнальный путь NF-κB-IL6-STAT3, что приводит к усилению канцерогенного потенциала и стволовости глиобластомы [41].

Множество механизмов иммуносупрессивного действия регуляторных T-лимфоцитов в микроокружении глиобластомы, с одной стороны, может служить основой для разработки таргетных препаратов, нацеленных на определенные метаболические пути и эффекты Treg, с другой стороны, подобное разнообразие создает сложности выбора необходимых точек воздействия для терапии.

Мишени регуляторных T-лимфоцитов для таргетной терапии

Регуляторные T-лимфоциты вносят существенный вклад в опухолевую прогрессию, инвазию и терапевтическую резистентность и могут выступать в качестве мишени для лечения пациентов с глиобластомой [42]. В настоящее время для таргетной терапии разрабатываются и проходят доклинические и клинические исследования препараты, направленные на различные типы мишеней и метаболические процессы Treg [43].

Системная деплеция регуляторных T-клеток может приводить к повышению противоопухолевого иммунитета, однако при этом сопровождается развитием тяжелых аутоиммунных реакций. Поэтому во многих исследованиях предпринимались попытки избирательного истощения регуляторных T-клеток только в опухоли, без воздействия на Tregs в здоровых тканях. Снижение активности и пролиферации эффекторных Т-клеток (в том числе за счет воздействия Treg) приводит к низкой эффективности, например, CAR-T-терапии. При этом было выявлено, что при комбинировании с терапией, направленной на истощение общего числа T-клеток, наблюдается повышение эффективности лечения CAR-T [44], а также радиоиммунотерапии [45].

Одним из подходов селективного воздействия на Treg являются препараты, нацеленные на рецепторы к определенным интерлейкинам, необходимым для функционирования регуляторных T-лимфоцитов. К таким, например, можно отнести препараты против альфа-цепи рецептора IL-2, CD25 [46]. Член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) OX40 (CD134) в основном экспрессируется CD4⁺ и CD8⁺ T-клетками, при этом инфильтрирующие опухоль Treg демонстрируют более высокую экспрессию OX40, чем периферические Treg. После активации TCR на TILs OX40 временно экспрессируется для передачи мощного костимулирующего сигнала, когда он связан с OX40L. Таким образом, агонисты OX40 могут усиливать противоопухолевый иммунитет [47]. Также в качестве мишени может выступать рецептор TNF CD27, а также его лиганд CD70 [48].

В качестве мишени для таргетных препаратов могут выступать метаболические пути активации и ингибирования регуляторных T-клеток, а также факторы транскрипции и различные костимулирующие молекулы [49]. К препаратам такого типа относятся, например, ингибиторы контрольных точек (CTLA-4, IDO, белка программированной клеточной смерти 1 или PD-1, T-клеточного иммуноглобулина 3 или Tim-3, сигнального пути STAT3 и др.), которые успешно применяют при некоторых злокачественных новообразованиях [50]. Рецептор CTLA-4 конститутивно экспрессируется на наивных Treg и других популяциях T-лимфоцитов, но в наибольшей степени его экспрессия выражена у опухоль-инфильтрирующих Treg. Моноклональные антитела против CTLA-4 могут истощать клетки Treg в опухолевом микроокружении посредством механизма антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности и тем самым усиливать противоопухолевый иммунитет [51]. У многих пациентов с глиобластомой лечение с помощью ICB (в том числе наиболее широко применяемых блокаторов PD-1 [52]) не показало достаточного эффекта, но, возможно, препараты нового поколения ингибиторов окажутся более эффективными [53].

Явление взаимной трансформации активированных Treg и нерегуляторных T-лимфоцитов, не экспрессирующих FOXP3 (Treg/Tconv), потенциально может быть использовано для терапии глиобластомы: смещение баланса в пользу неактивных регуляторных T-лимфоцитов снизит выраженность иммуносупрессии в микроокружении, что, в свою очередь, приведет к большей эффективности собственного иммунного ответа пациента и других видов терапии [54].

В настоящее время появляются данные о том, что Treg играют не такую однозначную роль в очаге опухоли, как считалось ранее. Многие исследования подтверждают противоопухолевую активность Treg и их корреляцию с улучшенным прогнозом при некоторых типах злокачественных новообразований (рак желудка, плоскоклеточный рак головы и шеи, колоректальный рак и др.) [55]. Регуляторные T-клетки, с одной стороны, подавляют воспалительные реакции, способствующие прогрессированию определенных видов опухолей, с другой стороны, некоторые субпопуляции Treg могут усиливать противоопухолевый иммунитет. Например, нацеливание на глюкокортикоид-индуцированный TNFR-связанный рецептор (GITR) регуляторных T-клеток с помощью агонистического антитела (α-GITR) способствует дифференцировке CD4⁺ Treg в эффекторные T-клетки. Перепрограммированные регуляторные T-лимфоциты экспрессируют гены, характерные для Th1, продуцируют IFN-γ и приобретают цитотоксическую активность против клеток глиомы, теряя при этом свою супрессорную функцию. В свою очередь, α-GITR и α-PD1 в сочетании со стандартным лечением впервые диагностированной глиобластомы повышали показатели выздоровления на экспериментальных моделях [56].

Помимо воздействия непосредственно на регуляторные T-лимфоциты, возможно влияние на привлечение Treg из периферической крови в микроокружение глиобластомы [57]. Модуляция взаимодействия хемокинов и рецепторов к ним может использоваться для разработки иммунотерапевтических препаратов для лечения злокачественных глиом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выраженная иммуносупрессия и высокая клеточная гетерогенность в очаге глиобластомы препятствуют развитию естественного противоопухолевого ответа и снижают результативность применяемых стандартных методов лечения.

Регуляторные T-лимфоциты играют неоднозначную роль: с одной стороны, Treg необходимы для поддержания иммунного гомеостаза в организме, с другой стороны, в микроокружении глиобластомы регуляторные T-клетки обеспечивают ускользание опухоли от иммунологического надзора. За счет межклеточных контактов и секреции противовоспалительных цитокинов, перфоринов, гранзимов и других биологически активных молекул регуляторные T-лимфоциты подавляют активность и пролиферацию эффекторных клеток в микроокружении, способствуя росту и прогрессии глиобластомы.

Разработка эффективной и высокоселективной терапии злокачественных глиом в настоящее время остается актуальной задачей для исследователей. Испытания новых терапевтических препаратов и модифицированных схем лечения необходимы для повышения уровня жизни и общей выживаемости пациентов с глиобластомой, а также снижения частоты возникновения побочных эффектов и рецидивов заболевания. Регуляторные T-клетки вносят существенный вклад в подавление противоопухолевого иммунитета и могут выступать в качестве мишени для онкотерапии. Для снижения активности и общего числа Treg применяют препараты, воздействующие на рецепторы к интерлейкинам, хемокинам, костимулирующие молекулы, метаболические пути регуляторных T-клеток и т. д.

Помимо лечения, направленного на регуляторные T-лимфоциты, в настоящее время происходит разработка, а также доклинические и клинические испытания других подходов: CAR-T-терапии, дендритных вакцин, микроРНК, мРНК, терапии онколитическими вирусами и др. Стоит отметить, что результативность лечения пациентов с глиобластомой (в особенности иммунотерапии и терапии онколитическими вирусами) во многом зависит от уровня локальной и системной супрессии иммунного ответа, что требует внимания при индивидуальном подборе терапии.

Более глубокое изучение функционального разнообразия и особенностей метаболизма регуляторных T-лимфоцитов как ключевого компонента опухолевой иммуносупрессии, а также исследование их взаимодействия с другими клетками в микроокружении может открыть новые возможности для терапии злокачественных глиом. В будущем применение различных терапевтических методов в составе комбинированного лечения, в том числе с таргетными препаратами Treg, может продемонстрировать большую эффективность в сравнении со стандартным подходом.