Оптимизация и валидация режимов инактивации спор Bacillus subtilis в среде сверхкритического CO₂: чистый газ, перекись водорода, надуксусная кислота

Введение. Инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), продолжают представлять существенную проблему для здравоохранения. Существующие методы стерилизации имеют ограничения по применимости к термочувствительным материалам и могут сопровождаться остаточной токсичностью или повреждением изделий. Стерилизация сверхкритическим диоксидом углерода, особенно в сочетании с окислительными добавками, представляется перспективной альтернативой, способной обеспечить требуемый уровень микробной безопасности при низких температурах и умеренных давлениях. Однако существующие данные демонстрируют значительную вариабельность результатов в зависимости от условий эксперимента, что указывает на необходимость оптимизации и валидации режимов обработки.

Цель. Оптимизация и валидация режимов стерилизации спор Bacillus subtilis в эксперименте с использованием сверхкритического диоксида углерода (scCO₂), включая чистый scCO₂, scCO₂ с перекисью водорода (H₂O₂) и scCO₂ с надуксусной кислотой (PAA).

Материалы и методы. Эксперименты проводили с использованием прототипа испытательного стенда для исследования режимов стерилизации. В качестве биологического индикатора использовали Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633 NCTC 10400. Исследование включало контаминацию титановых дисков спорами; обработку тремя режимами (чистый scCO₂, scCO₂ + H₂O₂, scCO₂  + PAA); микробиологический анализ с подсчетом выживших спор; статистическую обработку результатов. Для каждого режима были реализованы центральные композиционные планы экспериментов с варьированием температуры, давления и времени экспозиции. Эффективность оценивали по показателю log-reduction жизнеспособных спор, валидационные серии включали по 10 независимых повторов.

Результаты. Газодинамическая обработка чистым scCO₂ в диапазоне 35–60 °C, 70–120 атм, 60–120 мин оказалась неэффективной (максимальный log-reduction ≤ 0,8). Добавление окислителей существенно увеличивало степень инактивации: для режима scCO₂ + H₂O₂ (200 ppm) оптимальные параметры составили 37,9 °C, 120 атм, 30 мин (log-reduction 4,4 ± 0,3; CV = 7,3%); для scCO₂ + PAA (50 ppm) — 45 °C, 94 атм, 10 мин (log-reduction 6,0 ± 0,3; CV = 4,9%), что соответствует требованиям уровня гарантии стерильности (SAL) для медицинских изделий. Режим с PAA обеспечил статистически значимо более высокую эффективность по сравнению с H₂O₂ (t-тест, p < 0,001).

Выводы. Методика стерилизации на основе сверхкритического диоксида углерода с добавлением перекиси водорода или надуксусной кислоты обеспечивает эффективную инактивацию спор Bacillus subtilis при параметрах, соответствующих низкотемпературной обработке термочувствительных медицинских материалов, и удовлетворяет современным требованиям к стерильности медицинских изделий.

1. Rowan NJ, Kremer T, McDonnell G. A review of Spaulding’s classification system for effective cleaning, disinfection and sterilization of reusable medical devices: viewed through a modern-day lens that will inform and enable future sustainability. Science of the Total Environment. 2023;878:162976. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2023.162976

2. Spaulding AB, Watson D, Dreyfus J, Heaton P, Grapentine S, Bendel-Stenzel E, et al. Epidemiology of bloodstream infections in hospitalized children in the United States, 2009– 2016. Clinical Infect Diseases. 2019;69(6):995–1002. https://doi.org/10.1093/cid/ciy1030

3. Stewart S, Robertson C, Pan J, Kennedy S, Dancer S, Haahr L, et al. Epidemiology of healthcare-associated infection reported from a hospital-wide incidence study: considerations for infection prevention and control planning. Journal of Hospital Infection Society. 2021;114:10–22. https://doi.org/10.1016/j.jhin.2021.03.031

4. Арутюнов СД, Янушевич ОО, Корсунский АМ, Подпорин МС, Салимон АИ, Романенко ИИ и др. Сравнительный анализ эффективности современных методов стерилизации инструментов и место газоводинамической обработки диоксидом углерода. Российская стоматология. 2022;15(1):12–9. https://doi.org/10.17116/rosstomat20221501112

5. Spilimbergo S, Bertucco A, Lauro FM, Bertoloni G. Inactivation of Bacillus subtilis spores by supercritical CO₂ treatment. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 2003;4(2):161–5. https://doi.org/10.1016/S1466-8564(02)00089-9

6. Warambourg V, Mouahid A, Crampon C, Galinier A, Claeys-Bruno M, Badens E. Supercritical CO₂ sterilization under low temperature and pressure conditions. The Journal of Supercritical Fluids. 2023;203:106084. https://doi.org/10.1016/j.supflu.2023.106084

7. Zhang J, Davis TA, Matthews MA, Drews MJ, LaBerge M, An YH. Sterilization using high-pressure carbon dioxide. The Journal of Supercritical Fluids. 2006;38(3):354–72. https://doi.org/10.1016/j.supflu.2005.05.005

8. Hossain MS, Nik Ab Rahman NN, Balakrishnan V, Alkarkhi AFM, Rajion ZA, Ab Kadir MO. Optimizing supercritical carbon dioxide in the inactivation of bacteria in clinical solid waste by using response surface methodology. Waste Management. 2015;43:402–9. https://doi.org/10.1016/j.wasman.2015.01.003

9. Qiu QQ, Leamy P, Brittingham J, Pomerleau J, Kabaria N, Connor J. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research B Applied Biomaterials. 2009;91B(2):572–8. https://doi.org/10.1002/jbm.b.31431

10. Salimon AI, Statnik ES, Kan Y, Yanushevich OO, Tsarev VN, Podporin MS, et al. Comparative study of biomaterial surface modification due to subcritical CO₂ and autoclave disinfection treatments. The Journal of Supercritical Fluids. 2022;191:105789. https://doi.org/10.1016/j.supflu.2022.105789

11. McFarland J. The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. JAMA. 1907;49(14):1176–8. https://doi.org/10.1001/jama.1907.25320140022001f

12. Setlow B, Korza G, Blatt KMS, Fey JP, Setlow P. Mechanism of Bacillus subtilis spore inactivation by and resistance to supercritical CO₂ plus peracetic acid. Journal of Applied Microbiology. 2016;120(1):57–69. https://doi.org/10.1111/jam.12995

13. von Woedtke T, Kramer A. The limits of sterility assurance. GMS Krankenhhyg Interdiszip. 2008;3(3):Doc19.

14. Rutala WA, Weber DJ. Sterilization, high-level disinfection, and environmental cleaning. Infectious Disease Clinics of North America. 2011;25(1):45–76. https://doi.org/10.1016/j.idc.2010.11.009

15. Shenoy ES, Weber DJ, McMullen K, Rubin Z, Sampathkumar P, Schaffzin JK, et al. Multisociety guidance for sterilization and high-level disinfection. Infection Control Hospital Epidemiology. 2025. https://doi.org/10.1017/ice.2025.41

16. Dillow AK, Dehghani F, Hrkach JS, Foster NR, Langer R. Bacterial inactivation by using near- and supercritical carbon dioxide. PNAS. 1999;96(18):10344–8. https://doi.org/10.1073/pnas.96.18.10344

17. White A, Burns D, Christensen TW. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 2006;123(4):504–15. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2005.12.033

18. Soares GC, Learmonth DA, Vallejo MC, Davila SP, González P, Sousa RA, et al. Supercritical CO₂ technology: The next standard sterilization technique? Material Science and Engineering: C. 2019;99:520–40. https://doi.org/10.1016/j.msec.2019.01.121