Фармакогенетические факторы, определяющие метаболизм и безопасность антиконвульсантов с ароматической структурой у жителей России

ВВЕДЕНИЕ

Противоэпилептические препараты (ПЭП), или антиконвульсанты, являются широко использующейся в неврологической и психиатрической практике группой лекарственных препаратов, применяющихся не только для контроля эпилептических приступов, но и при лечении мигрени¹, кластерной головной боли², нейропатической боли³, для коррекции психотических и поведенческих расстройств при когнитивных расстройствах у пожилых людей⁴, а также в качестве стабилизаторов настроения и анксиолитических средств [1]. К препаратам, имеющим наиболее изученные фармакогенетические аспекты безопасности применения, относятся карбамазепин, окскарбазепин, ламотриджин, фенитоин. Их объединяет наличие бензольного кольца в химической структуре, в силу чего в англоязычной литературе их называют «ароматическими антиконвульсантами» [2]. Применение этой группы препаратов сопряжено с низким, но серьезным с клинической точки зрения риском развития реакций гиперчувствительности, в числе которых эпидермолитическая лекарственная реакция (ЭЛР) (синдром Стивенса – Джонсона (ССД)), токсический эпидермальный некролиз (ТЭН), системная лекарственная реакция с полиорганным поражением (англ. DRESS, Drug Reaction with Eosinophilia and Systemic Symptoms).

ССД и ТЭН — острые тяжелые аллергические реакции, характеризующиеся обширными поражениями кожи и слизистых оболочек, которые в настоящее время рассматриваются не как отдельные заболевания, а как различные стадии одного патологического процесса [3][4]. Заболеваемость ССД составляет 2,5–9,2 чел/млн/год с летальностью 4,1–16,9%; ТЭН — 0,94–1,9 чел/млн/год с летальностью 14,8–29,9% [4]. Для DRESS-синдрома характерны распространенная (>50% площади тела) экзантематозная сыпь, лихорадка, лимфаденопатия, эозинофилия и поражение внутренних органов [5]. Точная заболеваемость DRESS неизвестна, и для популяции лиц, получающих фармакотерапию, оценивается в 1 случай на 10 000 экспозиций, летальность по разным оценкам составляет от 3,8 до 10–20% [6][7]. Ламотриджин входит в пятерку лекарственных средств с наиболее сильной ассоциацией с летальными исходами при развитии синдрома DRESS [8]. Кроме того, он занимает второе место среди препаратов, наиболее часто провоцирующих развитие этого синдрома [1].

Генетическая предрасположенность играет большую роль в вероятности реализации вышеназванных аллергических реакций и связана с носительством определенных аллелей человеческих лейкоцитарных антигенов A и B (англ. HLA-A, HLA-B, Human Leukocyte Antigens), которые входят в состав большого кластера генов, называющегося главным комплексом гистосовместимости. Высокий уровень доказательности установлен для ассоциации развития ЭЛР/DRESS при приеме фенитоина, ламотриджина, карбамазепина и окскарбазепина с носительством HLA-B*15:02 (1А) [9][10], а также для связи карбамазепин-индуцированных ЭЛР/DRESS с носительством HLA-A*31:01 (1A), HLA-B*15:11 (1A) и HLA-B*40:01 (2A) [10][11].

В настоящее время существуют два источника фармакогенетических рекомендаций для принятия решений о назначении ПЭП с ароматической структурой: рекомендации Консорциума по внедрению клинической фармакогенетики (англ. CPIC, Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium) [9][11] и рекомендации Датской рабочей группы по фармакогенетике (англ. DPWG, Dutch Pharmacogenetics Working Group) [10]. Согласно CPIC у «наивных» в отношении карбамазепина, окскарбазепина или фенитоина пациентов — носителей аллели HLA-B*15:02 следует избегать назначения данных препаратов; в случае применения пациентом целевого препарата на протяжении трех месяцев и более без развития кожных реакций терапия может быть продолжена независимо от генотипа HLA-B, поскольку индуцированные ЭЛР развиваются, как правило, в течение первых 4–28 дней лечения [9][11]. Аналогичный алгоритм принятия решений рекомендован для назначения карбамазепина при носительстве HLA-A*31:01: избегать назначения носителям аллели, за исключением ситуаций, когда карбамазепин применяется в течение трех месяцев и более [11].

DPWG регулирует более широкий перечень ситуаций, и при носительстве HLA-B*15:02 не рекомендуется прием ламотриджина, тогда как прием карбамазепина не рекомендуется при носительстве упомянутых в CPIC HLA-B*15:02 и HLA-A*31:01, а также HLA-B*15:11 [10].

Фенитоин и его более редко используемый предшественник фосфенитоин имеют достаточно узкое терапевтическое окно. Профиль его переносимости, помимо обсужденных выше аллергических реакций, отличает достаточно широкий спектр нежелательных явлений, в числе которых токсические эффекты в отношении центральной нервной системы, тошнота, рвота, гиперплазия десен, остеомаляция, угнетение кроветворения, когнитивные нарушения [9]. Риск их развития во многом зависит от скорости биотрансформации препарата, которая осуществляется изоферментом цитохрома Р450 CYP2C9. Существует множество аллельных вариантов гена CYP2C9, каждый из которых определяет прогнозируемую активность кодируемого фермента. Для описания влияния на ферментную активность отдельной аллели (гаплотипа) используется система оценки Activity Score (AS), согласно которой выделяют гаплотипы с нормальной (AS = 1), сниженной (AS = 0,5) и практически отсутствующей (AS = 0) активностью. Аннотация аллелей приведена в базе PharmGKB [12]. Наиболее распространенными вариантами являются CYP2C9*1 (AS = 1), CYP2C9*2 (AS = 0,5) и CYP2C9*3 (AS = 0). Клинически значимый фенотип метаболизма определяется на основе диплоидного генотипа пациента, то есть по сумме показателей AS двух унаследованных аллелей. В соответствии с международными рекомендациями суммарный показатель позволяет классифицировать тип метаболизма на следующие фенотипические группы: нормальный (AS = 2), промежуточный (1 ≤ AS < 2) и медленный (AS < 1). В рекомендациях CPIC регламентируется режим поддерживающего дозирования препарата в зависимости от типа метаболизма: при промежуточном типе с AS = 1 показано сокращение стандартной поддерживающей дозы на 25%, при медленном типе — на 50% при неизменном нагрузочном режиме дозирования [9].

Таким образом, учет фармакогенетических особенностей пациентов при назначении ПЭП с ароматической структурой позволяет осуществлять контроль рисков серьезных нежелательных явлений, развивающихся по механизму гиперчувствительности, а также прогнозировать скорость метаболизма отдельных препаратов и на основании этой информации подбирать режим дозирования, улучшая прогноз переносимости лечения.

Цель исследования — оценка распространенности основных фармакогенетических вариантов, ассоциированных с ответом на ПЭП с ароматической структурой, с географической стратификацией и выделением популяций риска, в которых потенциально оправдана фармакогенетическая оценка при назначении препаратов данного класса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Исследование проведено на основе популяционной выборки из базы данных популяционных частот (GDB) ФГБУ «ЦСП» ФМБА России⁵. Объем выборки составил 120 979 человек (58 339 (48,2%) мужчин, средний возраст 50,1 ± 14,1 года (M ± σ) из 82 субъектов Российской Федерации). В анализе регионального распределения частот аллельных вариантов объединены участники из г. Москвы и Московской области, г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области, г. Севастополя и Республики Крым. Условия набора участников GDB описаны в одной из ранее опубликованных работ [13]. Для сравнительного анализа отобраны регионы, объем наблюдений в которых составляет 250 человек и более.

Выделение и секвенирование ДНК

Выделение геномной ДНК из образцов цельной крови проведено с помощью набора для выделения высокомолекулярной ДНК с магнитными частицами MagAttract HMW DNA Kit (Qiagen, Германия) с использованием роботизированных станций. Пробоподготовку полногеномных библиотек осуществляли с применением набора реагентов Illumina DNA Prep согласно рекомендациям производителя (Document No. 1000000025416 v10, Illumina, США) и набора индексов IDT-ILMN Nextera DNA UD Indexes Set A и Set B, с дальнейшим контролем качества. Полногеномное секвенирование выполнено на приборе Illumina NovaSeq 6000 с использованием набора реагентов S4 на 300 циклов (Illumina, США) для парно-концевых прочтений 2×150 п.о.

На этапе демультипликации данные секвенирования в формате BCL конвертировались в формат FASTQ программой Illumina bcl2fastq2 v2.20.0.422⁶. Для контроля качества секвенирования использовалась программа Illumina Sequencing Analysis Viewer v2.4.7⁷, для контроля качества прочтений (формат FASTQ.GZ) — биоинформатический инструмент FastQC v0.11.9⁸. Прочтения выравнивались на референсный геном GRCh38.d1.vd1⁹ с помощью программно-аппаратной платформы Illumina DRAGEN Bio-IT Platform v07.021.510.3.5.7¹⁰. Контроль качества выравниваний (в формате BAM) выполнялся с помощью DRAGEN, FastQC v0.11.9¹¹, samtools v1.13 [14] и mosdepth v0.3.1 [15]. Все образцы успешно прошли контроль качества по ключевым метрикам, в том числе по количеству дублированных прочтений на геном, по количеству невыровненных прочтений и т.п. Итоговое среднее покрытие по геному для каждого образца составило не менее 30x. Поиск малых генетических вариантов (до 50 п.н.) осуществлялся с помощью программного обеспечения Illumina Strelka2 v2.9.10 [16]. Проверка выборки на наличие в ней дубликатов проводилась с помощью программы Picard CrosscheckFingerprints [17] со встроенным map-файлом. Используемый пайплайн биоинформатической обработки валидирован (F-мера = 99,83%) на эталонном геноме HG001, предоставленном консорциумом Genome In A Bottle (GIAB) (v.3.3.2) [18].

Отбор фармакогенетических вариантов и статистический анализ данных

Отбор фармакогенетических вариантов для анализа осуществлялся по критерию вхождения в существующие клинические рекомендации по фармакогенетике (CPIC или DPWG). Данному критерию соответствовали аллельные варианты человеческого лейкоцитарного антигена HLA-B*15:02, HLA-B*15:11, HLA-A*31:01 и ген изофермента цитохрома CYP2C9. Установление гаплотипа CYP2C9 проводилось с применением алгоритма Panno, находящегося в открытом доступе¹². Было выполнено нефазированное HLA-типирование по шести основным локусам с использованием биоинформатических инструментов xHLA [ 04.10.2017] (по версиям двух баз данных IPD-IMGT/HLA: 3.22.0 [ 10.2015] и 3.45.1 [ 08.2021]) и HLAscan v2.1.4 [ 04.12.2019] (версия базы данных IPD-IMGT/HLA — 3.21.0 [ 07.2015]). Для каждой аллели устанавливалась частота встречаемости и 95% доверительный интервал (ДИ), рассчитанный методом Вильсона. В соответствии с аннотацией аллелей CYP2C9, приведенной в PharmGKB [13], для каждого наблюдения в выборке был рассчитан индекс активности CYP2C9. Дальнейший тип метаболизма субстратов фермента определялся на основании AS в соответствии с принятыми алгоритмами, и вычислялась доля лиц в популяции, требующая персонализированного дозирования фенитоина/фосфенитоина в соответствии с рекомендациями CPIC [9], а также суммарная доля лиц с промежуточным и медленным метаболизмом, которая далее обозначена как группа «замедленный метаболизм».

Статистический анализ данных производился с использованием языков программирования Python, версия 3.9. Для сравнения частот носительства HLA-аллелей и долей замедленных метаболизаторов субстратов CYP2C9 между регионами и популяционными значениями использовался z-тест для пропорций. Для коррекции на множественное тестирование применен метод Бенджамини — Хохберга, контролирующий частоту ложных открытий (False Discovery Rate, FDR) на уровне 5%. Достоверность ассоциаций устанавливалась при значении р < 0,05 либо интервальным методом при отсутствии пересечения доверительным интервалом определенного критического значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Риск развития тяжелых реакций гиперчувствительности при приеме противоэпилептических препаратов с ароматической структурой в популяции

Абсолютные значения и процентные частоты встречаемости аллелей риска HLA-B*15:02, HLA-B*15:11, HLA-A*31:01 составили 22 (0,01%), 134 (0,06%) и 6122 (2,53%) соответственно. При этом доля носителей этих аллелей оценивалась в 0,02% (HLA-B*15:02), 0,11% (HLA-B*15:11) и 5,06% (HLA-A*31:01). Наличие хотя бы одной аллели риска наблюдали у 5,18% населения преимущественно за счет HLA-A*31:01, так как остальные аллели отличаются крайне редкой встречаемостью в популяции. При оценке регионального распределения носительства аллелей риска были выявлены регионы как со статистически значимо более низкой, так и более высокой частотой носительства. В таблице 1 приведены данные по регионам, встречаемость аллелей риска ЭЛР/DRESS в которых была более высокой по сравнению с популяционной.

Для HLA-B*15:02 в целом по популяции характерна крайне редкая встречаемость, и в 53 из 68 регионов данная аллель не встречалась вовсе. Самая высокая по стране частота наблюдалась в Республике Калмыкия (0,52%, p-adj = 0,21). Для аллелей HLA-B*15:11 и HLA-A*31:01 могут быть выделены регионы риска, которые отчасти совпадают (табл. 1). В 33 регионах вариант HLA-B*15:11 не встречался. Оценка риска наличия одной из аллелей риска по регионам проиллюстрирована рисунком 1. Согласно интервальной оценке в республиках Саха (Якутия), Тыва, Бурятия, Калмыкия и Пермском крае достоверно выше риск носительства аллелей HLA-B*15:02, HLA-B*15:11 или HLA-A*31:01.

Метаболизм фенитоина в популяции

Информация о генотипе цитохрома CYP2C9 была доступна для 119 422 участников (48,4% мужчин). На рисунке 2 представлены частотные распределения наиболее распространенных аллелей, индекса активности фермента и типов метаболизма в популяции. Аллельные варианты *1 (референсный), *2 и *3 охватывают 99% всех встречающихся аллелей (рис. 2А).

Около ⅓ (33,6%) населения имеет замедленный (промежуточный или медленный) метаболизм субстратов CYP2C9, однако медленный тип метаболизма встречается достаточно редко (в 2% случаев). В таблице 2 приведены показатели по регионам со статистически значимо большей или меньшей встречаемостью замедленных метаболизаторов субстратов CYP2C9.

Ряд республик Северного Кавказа (Кабардино-Балкария, Ингушетия, Дагестан), республики Татарстан, Марий Эл и Чувашия можно охарактеризовать как регионы риска плохой переносимости при лечении фенитоином/фосфенитоином, а также других лекарственных средств, являющихся субстратами CYP2C9, которые не рассматриваются в настоящем исследовании. Напротив, в Якутии, Тыве, Калмыкии, Бурятии и Кемеровской области сниженная ферментная активность CYP2C9 встречается относительно редко.

Чтобы выяснить причину отличий регионов риска от популяции, мы проанализировали структуру аллельных вариантов CYP2C9. Различия могли быть вызваны либо повышенной частотой аллелей *2 и *3, либо наличием редких аллелей, характерных для конкретных регионов. Варианты, распространенность которых превышает 1% в регионе, приведены в таблице 3 в сравнении с общепопуляционными значениями.

Таким образом, повышенная частота носителей генотипов замедленного метаболизма субстратов CYP2C9 в Кабардино-Балкарии, Ингушетии и Дагестане реализуется за счет увеличения частоты встречаемости варианта CYP2C9*3, соответствующего крайне низкой ферментной активности. В Татарстане, Марий Эл и Чувашии наблюдается другая картина: при частоте аллелей *2 и *3, сопоставимой с таковой в популяции, основную роль играет относительно высокая распространенность аллели *29, которая обусловливает сниженную ферментную активность.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящего исследования позволили как выявить общепопуляционные тенденции и риски, связанные с приемом ПЭП, так и произвести стратификацию популяции, выделив биогеографические группы, в отношении которых требуется особая осторожность при назначении антиконвульсантов с ароматической структурой. В целом популяцию Российской Федерации можно охарактеризовать как имеющую низкий риск развития тяжелых токсико-аллергических реакций, таких как синдром Стивенса — Джонсона, токсический эпидермальный некролиз и синдром DRESS, при приеме ПЭП с ароматической структурой. Вместе с тем установлен умеренный риск промежуточного типа метаболизма фенитоина и сопряженной с ним потребности в сокращении поддерживающей дозы препарата на 25% [9]. Отсутствие учета этого фактора потенциально влечет за собой ухудшение переносимости лечения, временные и финансовые затраты, связанные со сменой ПЭП, а также возможное формирование лекарственной резистентности, вызванное этим процессом [19].

Население таких регионов, как Саха (Якутия), Тыва, Бурятия, Калмыкия, а также, в меньшей степени, Пермский край могут быть выделены как популяции высокого риска носительства аллельных вариантов, ассоциированных с тяжелыми реакциями гиперчувствительности при приеме карбамазепина и окскарбазепина за счет относительно высокой распространенности вариантов HLA-B*15:11 и HLA-A*31:01, однако в отношении ламотриджина и фенитоина такого вывода сделать нельзя, поскольку для реакций гиперчувствительности на эти препараты на данный момент имеется достоверная ассоциация только с аллелью HLA-B15:02, которая во всех биогеографических группах встречается с частотой менее 1%. По данным литературы, аллели HLA-B*15:02 и HLA-A*31:01 являются глобально редкими, однако частота их носительства имеет зависимость от происхождения. Повышенная встречаемость варианта HLA-B*15:02 описана у коренных жителей Восточной Азии (6,9%), Австралии и Океании (5,4%), Южной/Центральной Азии (4,6%), а варианта HLA-A*31:01 — у лиц европейского происхождения (3%) и испаноязычного населения Южной Америки (6%), а также в некоторых популяциях Восточной Азии (до 8%) [11]. В то же время выделенные нами регионы риска развития ЭЛР/DRESS неоднородны в отношении структуры аллелей, за счет которых этот риск реализуется. Для профилактики развития тяжелых реакций гиперчувствительности при приеме карбамазепина/окскарбазепина в республиках Саха (Якутия), Калмыкия и в Пермском крае представляется достаточным предварительное тестирование на носительство HLA-A*31:01, в республиках Тыва и Бурятия — на HLA-B*15:11 и HLA-A*31:01 с дальнейшим принятием решений на основании действующих рекомендаций CPIC [11], однако точное определение оптимального объема диагностики возможно после клинико-экономического анализа.

Структура аллельных вариантов CYP2C9 в популяции подчеркивает специфику Российской Федерации. С одной стороны, лидирующими аллельными вариантами, кроме «дикого» типа (*1), являются *2 и *3, что соответствует глобальной структуре и учитывается в рекомендованной диагностической панели определения генотипа фермента [21]. Частота CYP2C9*2 (0,096) несколько выше, чем в европейской популяции (0,076), и ближе всего по своему значению к аналогичному показателю ближневосточной популяции (0,083) [12][21]. Наряду с этим в российской популяции почти 2% населения являются носителями исключительно редкой во всех биогеографических группах [21] аллели CYP2C9*29, кодирующей фермент со сниженной активностью (AS = 0,5) и не включенной международными рекомендациями даже в расширенную диагностическую панель [20].

Анализ распространенности генетически обусловленного замедленного метаболизма фенитоина показал, что в целом российская популяция характеризуется высокой (33,6%) распространенностью этого явления, что необходимо принимать во внимание при назначении не только фенитоина/фосфенитоина, но и варфарина [22], ряда нестероидных противовоспалительных средств [23] и некоторых других препаратов, биотрансформация которых проходит при участии изофермента CYP2C9. Проблема сниженной ферментной активности CYP2C9 особенно актуальна в республиках Татарстан, Марий Эл, Чувашии, Кабардино-Балкарии, Ингушетии, Дагестан, в которых показатель частоты генотипа, соответствующего сниженной активности CYP2C9, превышает популяционный и достигает 37–46%. При этом источник, лежащий в основе, принципиально различный для группы республик Северного Кавказа и для Татарстана, Марий Эл и Чувашии. В первом случае изменено распределение частых аллельных вариантов в сторону преобладания аллели CYP2C9*3, соответствующей крайне низкой ферментной активности, поэтому для жителей Кабардино-Балкарии, Ингушетии и Дагестана может быть рекомендовано определение носительства аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 при персонализации терапии фенитоином/фосфенитоином и другими препаратами, метаболизирующимися CYP2C9. В Чувашии, Татарстане и Марий Эл отличие от популяции можно назвать качественным, поскольку в реализации риска замедленного метаболизма задействована другая аллель, не имеющая высокого распространения в популяции в целом, — CYP2C9*29. По этой причине можно считать перспективным включение данного варианта в диагностическую панель, специфичную для рассматриваемых регионов, однако, как и в случае с HLA-типированием, вопросы эффективности внедрения таких диагностических технологий могут быть прояснены только после клинико-экономического анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование продемонстрировало значительную вариабельность распространенности генетических маркеров, ассоциированных с замедленным метаболизмом и риском нежелательных реакций при применении антиконвульсантов с ароматической структурой, среди населения Российской Федерации. Установлено редкое носительство аллелей, увеличивающих риск ЭЛР/DRESS в популяции в целом, однако высокая представленность некоторых из них (HLA-B*15:11 и HLA-A*31:01) среди жителей Якутии, Тывы, Бурятии, Калмыкии, Пермского края позволяет рекомендовать генетическое тестирование на носительство этих вариантов перед назначением карбамазепина и окскарбазепина в данных регионах. Применение ламотриджина представляется в равной степени безопасным во всех биогеографических группах российской популяции ввиду низкой распространенности аллельного варианта HLA-B*15:02. В отношении фенитоина выявлено, что около трети населения имеет генетически обусловленный замедленный метаболизм препарата, требующий коррекции дозы, особенно в республиках Северного Кавказа, а также в Татарстане, Республике Марий Эл и Чувашии. Исходя из этого генотипирование CYP2C9 перед началом терапии фенитоином особенно важно для населения данных регионов, но в целом может быть рекомендовано всем жителям России.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.Д. Спектор — концептуализация, формальный анализ; В.С. Юдин — методология, создание рукописи и ее редактирование; А.А. Мамчур — создание черновика рукописи; А.М. Румянцева — ресурсы; М.В. Иванов — программное обеспечение; С.И. Митрофанов — верификация данных; Е.А. Снигирь — проведение исследования; А.А. Кескинов — администрирование проекта, руководство планированием и выполнением исследовательской деятельности; С.М. Юдин — руководство исследованием; Д.А. Каштанова — координация планирования и осуществления научно-исследовательской деятельности.