Изучение процессов биотрансформации и фармакологической активности виолуровых кислот и их метаболитов в экспериментах in vivo

ВВЕДЕНИЕ

Антигипоксанты, антиоксиданты, адаптогены, актопротекторы и другие лекарственные препараты, повышающие адаптивные возможности организма, играют заметную роль в современной фармакологии. Препараты этих фармацевтических групп, прежде всего антигипоксанты, широко востребованы в медицине: они используются в хирургической практике [1], кардиологии [2], неврологии [3][4], спортивной и экстремальной медицине [5], психиатрии [6], при травмах головного мозга и нарушениях мозгового кровообращения [7][8], лечении интоксикаций печени [9] и во многих других областях [10]. При этом разработка новых антигипоксических препаратов и поиск новых подходов в терапии гипоксических состояний продолжают оставаться актуальными [11].

Приоритетными направлениями поиска антигипоксантов являются оригинальные группы синтетических гетероциклических веществ, среди которых могут быть обнаружены препараты, позволяющие задействовать дополнительные механизмы повышения адаптационного резерва организма. В этом плане значительный интерес вызывают 5-оксииминобарбитуровые кислоты, известные как виолуровые кислоты (ВК), которые представляют собой группу гетероциклических оксимов с перспективными фармакологическими свойствами [12]. Простейшее производное данного ряда — незамещенная виолуровая кислота (ВК1), структура которой приведена на рисунке 1. Данное вещество было исследовано в работе¹, где установлено, что оно обладает высокой антидотной активностью на моделях гемической гипоксии, вызванной угарным газом и метгемоглобинобразующими ядами (нитритом натрия, анилином и др.), превосходя такие стандарты, как унитиол, амтизол, гутимин и метиленовый синий. Также ВК1 демонстрировала хорошие результаты на моделях гипобарической и гиперкапнической гипоксии. Другое производное этого ряда (2-тиовиолуровая кислота (ВК2)) аналогично обладало антидотной активностью при нитрит-индуцированной гемической гипоксии, но помимо этого ВК2 проявляла выраженное защитное действие на модели отека легкого, вызванного оксидом азота². 1-бутилвиолуровая кислота (ВК3), использованная в виде цинкового комплекса, проявила защитное действие при отравлении угарным газом, превосходя известный препарат ацизол, а также показала лечебный эффект у животных при отравлениях нейротоксикантами [12].

Для ВК1 и ее аналогов на биохимическом уровне отмечали антиоксидантные, мембраностабилизирующие свойства и способность повышать устойчивость гемоглобина in vitro³. [12][13]. Помимо перечисленных видов активности, в ряду ВК у различных производных были выявлены гепатопротекторные, антимикробные, противовирусные, анальгетические, транквилизирующие и другие свойства [14]. Отдельно следует отметить 1-(4-бромфенил)виолуровую кислоту (ВК4), которая была официально зарегистрирована в качестве гепатопротекторного лекарственного средства⁴.

Все это свидетельствует о виолуровых кислотах как о фармакологически перспективной группе, на основе которой возможна разработка новых лекарственных препаратов, в частности антигипоксантов, актопротекторов и антидотных средств, актуальных для современной медицины. Однако до настоящего времени биологические мишени и механизмы действия виолуровых кислот неизвестны. В связи с этим, учитывая ключевую роль данных о метаболизме препаратов для скрининга и фармацевтической разработки [15], изучение закономерностей распределения и биотрансформации виолуровых кислот in vivo имеет большое практическое значение.

Цель исследования — установление структуры продуктов метаболизма виолуровых кислот и их количественная оценка в эксперименте in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Методы физико-химического анализа

Для подтверждения молекулярной структуры синтезированных веществ использовали спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Спектры ¹Н и ¹³С ЯМР зарегистрированы в ДМСО-d₆ на приборе Bruker Avance 400WB при рабочей частоте 400 и 100 МГц соответственно. Электронные спектры синтезированных веществ в УФ- и видимой области записаны на сканирующем спектрофотометре Shimadzu UV-1800 с использованием стандартных кварцевых кювет. Анализ чистоты синтезированных веществ, идентификацию и оценку их количественного содержания в биосредах экспериментальных животных осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Shimadzu LC-20 Prominence, снабженном автосемплером и спектрофотометрическим детектором диодно-матричного типа. Разделение проводили на обращенно-фазной колонке монолитного типа Chromolit Performance-RP длиной 10 см при температуре колонки 40 °С. Скорость потока элюента составляла 5 мл/мин, в качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил (фаза А) и водный раствор ацетата аммония 0,1% (фаза Б) в режиме градиентного элюирования. Условия градиента: А 1–30% (0–3 мин), А 30% (3–5 мин).

Аналитические характеристики исследуемых веществ и их метаболитов, использованные для их идентификации и количественного анализа в биосредах, представлены в таблице 1.

В качестве иллюстрации на рисунке 2 представлены электронные спектры 1-бутилвиолуровой кислоты (ВК3) и ее метаболита — N,N’-дибутилпурпурата (М3).

Синтез исследуемых и стандартных веществ

Синтез всех исследуемых веществ был выполнен на базе ФГБУ НКЦТ им. С.Н. Голикова ФМБА России.

Виолуровые кислоты (ВК) синтезировали по общей методике патента [14]. Схема синтеза ВК включала два этапа. На первом этапе из замещенных мочевин и малонового эфира получали соответствующие производные барбитуровой кислоты, из которых путем нитрозирования на втором этапе получали целевые ВК. Чистота синтезированных веществ составляла не менее 98%.

Пурпуровая кислота в форме аммониевой соли (М1, мурексид) — коммерческий продукт (ч.д.а., «Ленреактив» (Россия)). Все прочие использованные в работе вещества — коммерчески доступные продукты.

Метаболиты производных виолуровых кислот — 2,2’-дитиопурпуровая кислота (М2) и N,N’-дибутилпурпуровая кислота (М3) были получены в форме аммониевой и калиевой солей соответственно по методике, описанной в работе [16], с чистотой не менее 95%.

Методика синтеза натриевой соли N,N’-ди-(4-бромфенил)пурпуровой кислоты (М4). 0,005 моль (1,56 г), 1-(4-бромфенил)виолуровой кислоты (ВК4) и 0,005 моль (1,41 г) 1-(4-бромфенил)барбитуровой кислоты [14] растворяли в 10 мл диметилсульфоксида (ДМСО) при 50 °С. К этому раствору при перемешивании добавляли 0,01 моль ацетата аммония, растворенного в 3 мл метанола. Полученную смесь перемешивали в течение 1 ч при 50 °С, затем разбавляли 25 мл 3% водного раствора гидрокарбоната натрия и выдерживали 1 ч при комнатной температуре для формирования осадка. Полученный осадок отделяли на фильтре Шотта, промывали 10 мл 1% вод­ного раствора гидрокарбоната натрия, затем 5 мл дистиллированной воды и сушили на воздухе до постоянного веса. Получали 1,35 г темно-красного порошка М4 с температурой разложения свыше 250 °С. Выход пурпурата М4 составил 78% от теоретического, чистота — не менее 95%.

Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), химический сдвиг мультиплета (δ), миллионных долей (м.д.): 7,23 (4Н, Ar), 7,66 (4Н, Ar), 10,5–11,5 уш. с или уширенный синглет (2Н, 2NH). Спектр ЯМР ¹³С (ДМСО-d₆), δ_С, м.д.: 121,1 (C⁵ + C⁵^a), 131,5 (4C_Ar), 131,6 (4C_Ar), 135,2 (4C_Ar), 149,9 (2C²O), 155–165 уш. с. (4СО).

Препарат амтизол, использованный в качестве референсного антигипоксанта, был синтезирован в форме сукцината по методике, описанной в патенте [17], чистота препарата составила не менее 98%.

Структура и чистота всех синтезированных веществ были подтверждены методами ЯМР и ВЭЖХ.

Животные и их содержание

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах возрастом 3 мес. массой 200–240 г, приобретенных в Филиале НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ — ПЛЖ «Рапполово». Животные содержались в стандартных условиях при 12-часовом световом режиме, получали стандартный корм для крыс и питьевую воду ad libitum в условиях свободного доступа. Животные при составлении экспериментальных групп рандомизировались по весу.

Определение виолуровых кислот и их метаболитов в моче крыс

Работа проведена на 16 животных, из которых было сформировано 4 группы по 4 особи на каждое исследуемое вещество. Введение осуществляли с помощью атравматического желудочного зонда. Производные ВК1 и ВК2 вводили животным в дозе 80 мг/кг м.т. в виде 5% водных суспензий с добавкой 2% Твин-80, а производные ВК3 и ВК4 вводили в дозе 100 мг/кг м.т. в виде 1% водных растворов с добавкой трис(оксиметил)аминометана (ТРИС). После введения веществ животных помещали в метаболические клетки для сбора мочи, где их содержали в течение 24 ч без доступа к пище, при этом доступ к воде не ограничивался. Сбор мочи осуществляли через заданные промежутки времени (4, 8 и 24 ч) с регистрацией объема. Полученные образцы мочи хранили в морозильной камере при -10 °С для последующего ВЭЖХ-анализа. Методики количественного анализа ВК и их метаболитов в моче были разработаны и валидированы в соответствии с отечественными и международными рекомендациями⁵.

Для количественного анализа веществ мочу разбавляли в 2 раза дистиллированной водой и исследовали методом ВЭЖХ. Объем вводимых проб составлял 10 мкл. Параллельно хроматографировали градуировочные растворы соответствующих стандартов. Линейная зависимость между площадью хроматографического пика и содержанием исследуемого вещества в пробе была установлена в диапазоне концентраций 0,1–50 мкг/мл. Количественное содержание соединения в образцах мочи рассчитывали на основе площади хроматографического пика и соответствующих аналитических характеристик, приведенных в таблице 1.

Изучение метаболизма 1-бутилвиолуровой кислоты (ВК3) по результатам анализа плазмы крови и органов крыс

Исследование проведено на 20 животных по 2 особи на каждую временную точку (15, 30, 60, 120, 180 мин). Для изучения биотрансформации и распределения ВК3 in vivo животные были распределены на 2 группы по 10 особей в зависимости от способа введения исследуемых соединений: внутрибрюшинного (1-я группа) и внутрижелудочного (2-я группа) пути введения вещества. Дозировка ВК3 в обоих случаях составляла 50 мг/кг м.т., исследуемое вещество вводили животным в виде 1% водного раствора с добавкой 0,7% ТРИС. По истечении указанных промежутков времени животных выводили из эксперимента декапитацией. У крыс забирали цельную кровь (4–6 мл) и отделяли плазму от эритроцитов путем центрифугирования крови при 6000 об/мин, а также отбирали внутренние органы (печень и почки). Пробы плазмы крови и органы замораживали сразу после отбора и хранили при -10 °C для последующего ВЭЖХ-анализа.

Подготовка образцов плазмы крови к ВЭЖХ-анализу. В центрифужную пробирку помещали 0,5 мл плазмы крови крысы, приливали 1,0 мл метанола, перемешивали и отделяли осадок белка центрифугированием 5 мин при 16 000 об/мин. Надосадочный раствор отделяли и анализировали методом ВЭЖХ, объем инжекции составлял 30 мкл. Содержание веществ ВК3 и М3 в образцах плазмы крови определяли из площади хроматографического пика при соответствующих аналитических характеристиках, приведенных в таблице 1. Методика расчета концентрации веществ ВК3 и его метаболита М3 в плазме крови была валидирована в соответствии с отечественными и международными рекомендациями⁶.

Подготовка образцов ткани печени к ВЭЖХ-анализу. 0,5 г образца печени крысы растирали в агатовой ступке до получения однородной кашицы. Растертый материал смешивали с 1 мл метанола, переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали 5 мин при 16 000 об/мин. Надосадочный раствор отделяли и анализировали методом ВЭЖХ, объем инжекции составлял 30 мкл. Подготовку образцов ткани почек к ВЭЖХ-анализу проводили так же, как и для печени.

Содержание веществ ВК3 и его метаболита М3 в образцах печени и почек определяли из площади хроматографического пика при соответствующих аналитических характеристиках, приведенных в таблице 1.

Для изучения антигипоксической активности 1-бутилвиолуровой кислоты (ВК3) и ее метаболита — N,N’-дибутилпурпурата калия (М3) формировали 4 экспериментальные группы (n = 6): № 1 — контроль, № 2 — эталон, № 3 и 4 — опытные группы. Исследование проводили на модели гемической гипоксии, вызванной смертельной дозой нитрита натрия, в соответствии с методическими рекомендациями по изучению антигипоксических средств⁷. Защитную активность оценивали в условиях профилактического внутрибрюшинного введения веществ. В качестве эталонного вещества был использован препарат Амтизол, который считается одним из наиболее универсальных антигипоксантов [18].

Контрольным животным группы № 1 вводили 0,9% раствора хлорида натрия в объеме 1 мл. Животным группы № 2 вводили амтизол сукцинат в дозе 100 мг/кг в виде водного раствора 10%. Животным групп № 3 и 4 вводили исследуемые вещества ВК3 и М3 соответственно в виде водных 7,5% растворов, дозировки веществ составляли 75 мг/кг.

Нитрит натрия (х.ч., «ЛенРеактив», Россия) вводили крысам подкожно в виде водного 2% раствора через 30 мин после введения исследуемых веществ. Доза нитрита натрия составляла 100 мг/кг, что на 25% превышало смертельную для крыс (LD₁₀₀ = 80 мг/кг). Животных на время эксперимента помещали в вольеры по 6 особей для свободного наблюдения за клинической картиной.

В ходе эксперимента регистрировали клинические проявления действия нитрита натрия и исследуемых веществ. Гибель животных фиксировали на момент остановки сердца. Наблюдения за выжившими животными проводили в течение 3 сут. Критериями эффективности исследуемых веществ служили увеличение продолжительности жизни животных и процент выживания по сравнению с контролем.

Статистическая обработка (расчет среднего значения и абсолютной погрешности) данных проведена с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн исследования in vivo в первую очередь был нацелен на идентификацию качественного состава метаболитов виолуровых кислот, что позволяло минимизировать число использованных в экспериментах животных.

Определение метаболитов в моче животных проводили после внутрижелудочного введения соответствующих веществ ВК1–ВК4. Сроки сбора мочи были выбраны так, чтобы оценить начальную, промежуточную и финальную стадии экскреции. При исследовании состава мочи экспериментальных животных методом ВЭЖХ во всех случаях, помимо неизмененных соединений ВК1–ВК4, были обнаружены соответствующие производные пурпуровой кислоты М1–М4, структуры которых приведены на рисунке 1.

Идентификация пурпуратов в моче была выполнена в каждом случае на основе сравнения времени удерживания на хроматограмме и диодно-матричном спектре с синтезированным стандартным веществом М1–М4. Как уже отмечалось выше, пурпураты обладают характерными спектрами поглощения в УФ- и видимой области (табл. 1 и рис. 2), что позволило, используя синтезированные стандарты М1–М4, однозначно идентифицировать их в составе биосред.

Количественные показатели выведения виолуровых кислот и их метаболитов с мочой у крыс за соответствующие промежутки времени представлены в таблице 2 и на рисунке 3.

Полученные результаты свидетельствуют, что образование пурпуратов является общей закономерностью биотрансформации виолуровых кислот в организме крыс. Из рассмотренных веществ в наибольшей степени метаболизируется 1-бутилвиолуровая кислота ВК3, около половины (47%) которой выводится с мочой в виде N,N’-дибутилпурпурата М3, а 53% — в неизмененном виде. Наименее склонным к метаболизму субстратом является 1-(4-бромфенил)виолуровая кислота ВК4, у которой степень конверсии в метаболит составляет лишь 15%.

Нельзя не отметить, что наблюдаемая метаболическая трансформация виолуровых кислот весьма необычна, и можно даже говорить о ее уникальности. Судя по структуре образующихся пурпуратов, в ходе биотрансформации виолуровых кислот протекает конденсация и сшивка двух фрагментов исходной молекулы, что нельзя отнести к общеизвестным путям метаболизма ксенобиотиков, таким как окисление, гидролиз, конъюгация и другие превращения [19]. Данная трансформация, по всей видимости, требует участия специфического биохимического механизма, так как случайная сшивка двух молекул ВК3 друг с другом представляется маловероятной ввиду низкой концентрации субстрата в организме, тем более что в растворах in vitro такая реакция для виолуровых кислот не характерна даже при значительно более высоких концентрациях.

Для объяснения протекающего процесса мы предположили механизм, схематично изображенный на рисунке 4. С химической точки зрения очевидно, что на одной из стадий реакции происходит восстановление оксимной группы ВК3, но сложнее объяснить, как восстановленный интермедиат в условиях организма сочетается с исходной молекулой. Здесь ключевую роль могут играть комплексообразующие свойства, которыми, как известно, обладают виолураты [20]. В результате образования комплекса 1 с катионом многовалентного металла (например, катионом железа, цинка, кальция или другим) две молекулы ВК группируются вокруг одного координирующего центра. Последующее ферментативное восстановление оксииминогруппы с образованием интермедиата 2 и его конденсация по механизму нуклеофильного замещения выглядит логичным продолжением процесса, приводящего к образованию новой хелатирующей системы — молекулы пурпурата М.

По предварительным данным⁸, из производных ВК1–ВК4 вещество ВК3 представляло наибольший интерес с точки зрения антигипоксической активности, поэтому оно было выбрано для углубленного исследования. В ходе проведения настоящей работы мы оценили динамику концентрации 1-бутилвиолуровой кислоты ВК3 и ее метаболита М3 в плазме крови крыс после внутрижелудочного и внутрибрюшинного введения ВК3. Результаты представлены в таблице 3.

Метаболит М3 появлялся в плазме крови уже на 15 мин в концентрации 0,10 мг/л после внутрижелудочного и 0,38 мг/л после внутрибрюшинного введения 1-бутилвиолуровой кислоты, что свидетельствовало о быстром протекании метаболизма (рис. 5). При этом судя по тому, что концентрация М3 в точке максимума не превышала 0,75 мг/л, существенного накопления метаболита в крови не наблюдалось, что было связано с его более быстрым, по сравнению с исходным веществом, элиминированием через почки с мочой. Пурпурат обнаруживали также в органах — печени и почках крыс, причем максимум концентрации после внутрибрюшинного введения достигался через 1 ч, то есть позже, чем в крови. Максимальное содержание пурпурата в гомогенате печени было 0,46 мг/кг, что в 1,6 раза ниже, чем в крови, а в почках — 1,23 мг/кг, что в 1,6 раза выше, чем в крови.

Для ответа на вопрос о биологической активности метаболита М3 мы провели экспериментальное исследование и показали, что этот продукт обладает выраженной антигипоксической активностью на модели гемической гипоксии у крыс. Профилактическое введение N,N’-дибутилпурпурата калия М3 полностью предотвращало гибель животных, получивших смертельную дозу нитрита натрия. Аналогичный защитный эффект демонстрировала 1-бутилвиолуровая кислота ВК3 (табл. 4).

Клиническая картина отравления у крыс развивалась через 25–30 мин после подкожного введения нитрита. Наблюдалась атаксия, одышка, затем судороги и гибель животных в группе контроля. У крыс, предварительно получивших вещества ВК3 и М3, симптомы отравления также отмечались, однако они были менее выраженными и практически исчезали спустя 2 ч после инъекции нитрита, а начиная с 4 ч все животные в этих группах выглядели абсолютно здоровыми. В тех же условиях эталонный препарат сравнения амтизол не предотвращал гибели животных, лишь на 23% продлевая время их жизни.

Таким образом, было установлено, что М3 является активным метаболитом кислоты ВК3 и, возможно, играет роль в развитии фармакологического эффекта последней. Данный результат также показывает, что пурпураты, биологическая активность которых ранее не исследовались, могут представлять интерес как потенциальные средства для купирования отравлений ядами метгемоглобинобразующего действия.

ВЫВОДЫ

1. Виолуровые кислоты метаболизируются в организме животных, образуя соответствующие производные пурпуровой кислоты.
2. Механизм биотрансформации виолуровых кислот в пурпураты включает восстановление оксииминогруппы и перекрестную конденсацию с молекулой исходного субстрата.
3. Виолуровые кислоты и их метаболиты выводятся из организма в значительной степени почками с мочой.
4. 1-бутилвиолуровая кислота ВК3 и ее метаболит N,N’-дибутилпурпуровая кислота М3 обладают выраженной защитной активностью при отравлении нитритом натрия.
5. Пурпуровые кислоты наравне с виолуровыми представляют интерес для дальнейшего изучения в качестве потенциальных средств купирования отравлений ядами-метгемаглобинобразователями.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: К.А. Краснов — научный замысел, разработка плана исследования, семантика, трактовка данных, подготовка черновика рукописи, окончательное утверждение публикуемой версии рукописи; К.А. Феклистова — синтез производных виолуровой и пурпуровой кислот; А.А. Краснова — спектрофотометрические исследования; С.С. Гафт — исследования методом ВЭЖХ; В.Т. Папп — контроль качества синтезированных субстанций, статистическая обработка результатов фармакокинетических исследований; М.В. Мелихова — изучение фармакологической активности соединений на животных; Н.А. Белякова — проведение фармакокинетических исследований. Все авторы участвовали в обсуждении результатов, подготовке и редактировании рукописи статьи.