Методика оценки влияния растворов биологически активных веществ на коагуляцию

Поиск новых антикоагулянтов требует простых и недорогих методов первичного определения их активности. Для лабораторной оценки состояния системы гемостаза широко используют клоттинговые тесты, т. е. модельные исследования, оценивающие с клинической точки зрения состояние системы гемостаза по скорости образования фибринового сгустка. Реактивы и приборы для их выполнения производят в России, они имеют низкую себестоимость и просты в применении, однако для исследования активности антикоагулянтов в методики измерения необходимо внести некоторые изменения. Целью работы было показать работоспособность протокола тестирования антикоагуляционной активности растворов с помощью модифицированных стандартных клинических тестов на измерение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и тромбинового времени (ТВ). Использовали реактивы для измерения АЧТВ, ТВ и ПВ, а также гепарин отечественного производства и два рекомбинантных белка-антикоагулянта медицинской пиявки, полученные в нашей лаборатории. Проводили клоттинговые тесты с добавлением в реакционную смесь антикоагулянтов, определяли работоспособность и границы применимости использованных методов. При исследовании гирудина, гепарина и цистеин-богатого антикоагулянта медицинской пиявки с помощью измерения АЧТВ, ТВ и ПВ продемонстрировано дозо-зависимое увеличение времени образования сгустков. Определена совместимость методов с использованием некоторых распространенных компонентов буферных растворов, используемых в биохимических исследованиях. Показано, что после небольших модификаций стандартных клоттинговых методов определения параметров гемостаза можно использовать их для тестирования растворов новых потенциальных антикоагулянтов.

1. Баркаган З. С. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Москва: ООО "Медико-технологическое предприятие «Ньюдиамед», 2008; 292 с.

2. Winter W, Flax S, Harris N. Coagulation testing in the core laboratory. Laboratory Medicine. 2017; 48 (4): 295–313. Available from: https://doi.org/10.1093/labmed/.

3. Макаров В. А., Спасов А. А., Плотников М. Б., Белозерская Г. Г., Васильева Т. М., Дрозд Н. Н., и др. Методические рекомендации по изучению лекарственных средств, влияющих на гемостаз. В книге: Миронов А. Н., Бунятян Н. Д., Васильев А. Н., Верстакова О. Л., Журавлева М. В., Лепахин В. К., и др, редакторы. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012; с. 453–479.

4. Manuvera VA, Kharlampieva DD, Bobrovsky PA, Grafskaia EN, Brovina KA, Lazarev VN. New anticoagulant protein from medicinal leech. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2024; 696: 149473. Available from: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2024.149473

5. Nutt EM, Jain D, Lenny AB, Schaffer L, Siegl PK, Dunwiddie CT, Purification and characterization of recombinant antistasin: a leech-derived inhibitor of coagulation factor Xa, Arch Biochem Biophys. 1991; 285: 37–44. Available from: https://doi.org/10.1016/0003-9861(91)90325-D.

6. Müller C, Mescke K, Liebig S, et al. More than just one: multiplicity of Hirudins and Hirudin-like Factors in the Medicinal Leech, Hirudo medicinalis. Mol Genet Genomics. 2016; 291: 227–240. Available from: https://doi.org/10.1007/s00438-015-1100-0.

7. Onishi A, St Ange K, Dordick JS, Linhardt RJ. Heparin and anticoagulation. Front Biosci Landmark Ed. 2016; 21 (7): 1372– 92. Available from: https://doi.org/10.2741/4462.