Использование лактулозы в составе криоконсерванта для сохранения клеток крови

ВВЕДЕНИЕ

Проблема сохранения клеток крови вне организма является весьма актуальной для практической медицины. Криоконсервация позволяет длительно хранить биообразцы без изменений клеточной структуры с поддержанием их функциональной активности. Использование жидкого азота требует громоздкого, дорогостоящего оборудования, регулярного пополнения его запасов, что сказывается на себестоимости хранения материала и перевозки образцов [1], в связи с чем востребованы эффективные криоконсерванты для температурного диапазона от -20 до -80 °С. Для криоконсервации характерным недостатком является возможное разрушение клеточных оболочек, возникающее вследствие недостаточной эффективности существующих криоконсервантов [2]. В то же время криоагенты должны обладать низкой токсичностью [3][4], использование которых не будет приводить к потере фенотипических и функциональных свойств биоматериала, в связи с чем существует потребность в поиске низкотоксичных биосовместимых криоагентов [5].

Наилучшие результаты достигаются при использовании комбинированных криоконсервантов, включающих эндо- и экзоцеллюлярные криопротекторы [6]. Для уменьшения токсического действия криосистем дополнительно вносят в качестве криоагентов природного происхождения липиды, белки, углеводы [7–10], аминокислоты [11] и многоатомные спирты [12]. Одним из перспективных классов криопротекторов являются низкомолекулярные углеводы [13]. Выраженным защитным действием на клеточные мембраны обладает и дисахарид трегалоза [14]. Смеси сахаров и полиолов рассматриваются в качестве естественной эвтектической системы [15]. В настоящее время в литературе недостаточно экспериментальных данных о влиянии ряда углеводов на клетки при использовании их в качестве криопротекторов, в частности дисахарида лактулозы. Лактулоза — безопасное соединение для всех возрастных групп, в том числе для детей младше одного года [16]. При исследовании лактулозы данных о токсическом, тератогенном и мутагенном действии в клинических исследованиях с участием людей получено не было [17]. При этом отмечены защитные свойства лактулозы на микроорганизмы при их заморозке [18][19].

В настоящее время возросла потребность в постоянном наличии запасов полноценной крови и ее компонентов [20]. Образцы свежей цельной крови являются наиболее предпочтительными для анализа, но недостатком работы с ней является необходимость ее быстрого анализа после взятия биопробы и ограниченное количество повторных проверок, которые могут быть выполнены без дополнительного взятия крови [21]. Описан опыт криоконсервирования в полевых условиях капиллярной крови с последующим анализом методом цитометрии [22], однако аналогичных данных о криоконсевировании венозной крови нет. Таким образом, актуален анализ морфофункциональных параметров криоконсервированной цельной венозной крови в аспекте поиска критериев, позволяющих увеличить сроки хранения стабилизированных образцов крови без особых изменений аналитических методик и определяемых показателей крови.

Цель работы — оценка морфофункциональных особенностей форменных элементов крови в криоконсерванте с лактулозой на основании лейкоцитарных, тромбоцитарных и эритроцитарных параметров для хранения цельной крови при умеренно-низкой температуре (–20 °С).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено с участием 30 здоровых женщин-доноров в возрасте 18–23 лет. Все участницы были распределены по фазе менструального цикла (фолликулярная фаза). Критериями включения в исследование было отсутствие у женщин хронических заболеваний в периоде обострения, вредных привычек и видимых признаков аллергического или инфекционного заболевания. Всеми участницами было подписано информированное согласие об участии в исследовании. Объектом исследования была периферическая венозная кровь, стабилизированная 3-замещенной калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (К3 ЭДТА) in vitro. Пробы венозной крови объемом 15 мл отбирали однократно в утренние часы из локтевой вены в специализированные вакуумные пробирки для гематологических исследований с К3 ЭДТА.

Из числа проб были сформированы три группы. В контрольную группу включили 10 образцов крови, в которой исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови при температуре +20 ± 1,0 °С. В 1-ю опытную группу было включено 10 образцов крови, в которые предварительно был внесен модельный криоконсервант. Данные образцы исследовали по истечении 4 ч при температуре +20 ± 1,0 °С. Во 2-ю опытную группу вошли 10 образцов крови, в которые был внесен модельный криоконсервант, с последующим введением образцов в состояние холодового анабиоза при температуре –20 ± 1,0 °С на 24 ч для оценки сохранности образцов после однократного цикла замораживания/оттаивания. Далее образцы размораживали и исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови при температуре +20 ± 1,0 °С.

При приготовлении модельного криоконсерванта был использован 0,9 % раствор хлорида натрия для поддержания изотонической концентрации. В качестве криопротекторов, проникающих в клетку, использовали глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО), в качестве не проникающего — дисахарид лактулозу. Оптимизация состава криоконсерванта проводилась за счет варьирования массовых долей компонентов. Конечный состав модельного криоконсерванта имел следующие соотношения компонентов: глицерин (чда) — 20%, ДМСО (хч) — 10%, лактулоза (торговая марка «Лактусан» по ТУ 9229-004-53757476–04) — 2,5% и изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия до 100%. Приготовленный раствор автоклавировали (без ДМСО) при 1,2 атм в течение 30 мин и хранили в холодильнике при температуре +2…+4 °C. При соприкосновении с воздухом ДМСО окисляется, распадаясь на соединения, усиливающие токсичность химического вещества, поэтому автоклавированию не подлежит. Стерилизацию ДМСО осуществляли методом стерилизующего фильтрования с последующим хранением ДМСО в стеклянных стерильных пробирках при температуре –10 °С. Размораживание ДМСО проводилось на водяной бане UТ-4334 («ULAB», Россия) при температуре 37 ± 1 °С. ДМСО вносили в готовый стерильный модельный криоконсервант непосредственно перед замораживанием опытных образцов.

В образцы 1-й и 2-й опытных групп добавляли с помощью дозаторов сменного объема модельный криоконсервант в количестве 500 мкл при соотношении венозная кровь / криоконсервант 2:1 по объему. Пробирки герметизировали пробками, содержимое перемешивали в течение 10 мин с использованием орбитального шейкера (PSU-10i, Латвия). Далее спустя 4 ч образцы 1-й опытной группы исследовали при температуре +20 ± 1,0 °С. Образцы 2-й опытной группы помещали в морозильную камеру электроморозильника с температурой –20 ± 1,0 °С и выдерживали 24 ч. После этого образцы размораживали на водяной бане UТ-4334 («ULAB», Россия) в ручном режиме при температуре +37 ± 1 °С в течение 1 мин. Далее исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови при температуре +20 ± 1,0 °С. Компьютерное цитоморфометрическое исследование клеток крови выполняли на аппаратно-программном комплексе «МЕКОС-Ц2» («Медицинские компьютерные системы», Россия). При проведении in vitro диагностических тестов общего анализа крови (ОАК) в лабораторных условиях использовали автоматический гематологический анализатор «Гемалайт 1270» (Dixion, Россия).

Для обработки полученных результатов использовали программное обеспечение статистический пакет версии IBM SPSS Statistic 23.0 (IBM Corp., Armonk, NY, США). Характер распределения величин изучаемых показателей оценивали с помощью W-критерия Шапиро — Уилка. Уровень статистической значимости межгрупповых различий при соответствии распределения значений показателя закону нормального распределения оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для несвязанных выборок, для показателей с ненормальным распределением — при помощи непараметрического U-критерия Манна — Уитни. Для показателей с нормальным распределением вычисляли среднее значение (М), ошибку среднего (m) и стандартное отклонение (δ). Межгрупповые различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования проводили анализ состояния лейкоцитарного звена в опытных и контрольной группах (в 1-й опытной группе с криоконсервантом при температуре +20 ± 1,0 °С и 2-й опытной группе с криоконсервантом при температуре –20 ± 1,0 °С). Соответствующие данные представлены в таблице 1.

При анализе лейкоцитарных показателей как в 1-й, так и во 2-й опытных группах по сравнению с контролем отмечено статистически значимое снижение количества лейкоцитов, наиболее выраженное во второй опытной группе (3,94 ± 0,87)×10⁹/л (р < 0,01) против (4,55 ± 0,83)×10⁹/л в первой опытной группе и (5,60 ± 0,92)×10⁹/л в контроле соответственно. При этом значение средних клеток достоверно увеличено как в 1-й, так и во 2-й группе в сравнении с контролем, что свидетельствует о снижении распознавания лейкоцитарных клеток анализатором крови. Несмотря на существенные межгрупповые различия, данный показатель находился в диапазоне физиологических референсных значений. Процент сохранности лейкоцитов в образцах крови с внесенным криоконсервантом (температура +20 ± 1,0 °С) составил 81 ± 0,89 %, при воздействии отрицательных температур (-20 ± 1,0 °С) — 88,6 ± 0,41%.

Компьютерная морфометрия позволяет получить математические характеристики клеточной популяции, а также дает возможность судить об активности внутриклеточных процессов [23]. Для оценки функционального состояния клеток проводили анализ компьютерной цитоморфометрии лейкоцитов в контрольной группе и опытных группах (в 1-й опытной группе с криоконсервантом при температуре +20 ± 1,0 °С и 2-й опытной группе с криоконсервантом при температуре –20 ± 1,0 °С). Соответствующие данные представлены в таблице 2.

Анализ данных компьютерной цитоморфометрии лейкоцитов показал, что во 2-й группе (образцы с консервантом, замороженные при –20 ± 1,0 °С) значительно возрастала оптическая плотность цитоплазмы (до 1,03 ± 0,01 у.е.) как по сравнению с контролем (0,66 ± 0,01 у.е.), так и с 1-й опытной группой (0,50 ± 0,01 у.е.), что, вероятно, подтверждает увеличение проницаемости в клетку эндоцеллюлярных криоагентов.

Также проводили анализ эритроцитарных показателей в контрольной группе и опытных группах (в 1-й опытной группе с криоконсервантом при температуре +20 ± 1,0 °С и во 2-й опытной группе с криоконсервантом при температуре –20 ± 1,0 °С). Соответствующие данные представлены в таблице 3.

При выполнении общего анализа крови были получены значения, свидетельствующие об изменении количественных и расчетных показателей, а именно был достоверно снижен уровень общего гемоглобина крови как в 1-й, так и во 2-й опытной группе (119,25 ± 4,27 и 111,64 ± 4,42 г/л) по отношению к группе контроля соответственно.

Также отмечали снижение среднего содержания гемоглобина в эритроцитах в двух опытных группах в сравнении с контрольной группой. Данные показатели имеют тенденцию к снижению, что косвенно отражает картину предразведения исследуемой пробы, однако можно сказать, что консервант в условиях комнатной температуры не приводит к критически значимым изменениям компонентов крови. Снижение как общего гемоглобина, так и его среднего содержания в клетках говорит о процессах повышения трансмембранной проницаемости, при этом данные показатели в опытных группах не выходили за рамки референсного диапазона физиологически допустимых значений.

Сохранность эритроцитов в образцах крови с внесенным криоконсервантом (температура +20 ± 1,0 °С) составила 89,00 ± 0,20 %, при воздействии отрицательных температур (-20 ± 1,0 °С) — 92,10 ± 0,31%.

В ходе проведения компьютерной цитоморфометрии эритроцитов в обеих опытных группах по сравнению с контрольной достоверно увеличивалась площадь клетки в 1-й группе (значение составило 15,00 ± 1,22 мкм²), во 2-й группе — 22,00 ± 1,45 мкм² против 14,00 ± 2,10 мкм² в контроле. Значение среднего диаметра клетки имеет тенденцию к увеличению и в 1-й группе составляет 6,11 ± 0,91 мкм, во 2-й группе — 9,04 ± 1,34 мкм в сравнении с группой контроля 7,01 ± 1,12 мкм. Увеличение как площади, так и диаметра эритроцитов свидетельствует о возможном повышении проницаемости в клетку примененного криоагента. Соответствующие данные представлены в таблице 4.

При сравнительном анализе тромбоцитарных показателей достоверно снижалось количество тромбоцитов. В 1-й группе значение составляло (198,60 ± 5,36)×10⁹/л, во 2-й группе (181,50 ± 5,71)×10⁹/л против контрольных значений на уровне (230,08 ± 6,31)×10⁹/л. Снижение количества клеток, вероятнее всего, обусловлено увеличением объема исследуемой пробы на фоне внесения криоконсерванта. В то же время отмечена тенденция к увеличению коэффициента больших тромбоцитов в обеих опытных группах в сравнении с группой контроля, соответствующие данные приведены в таблице 5.

Сохранность тромбоцитов в образцах крови с внесенным криоконсервантом (температура +20 ± 1,0 °С) составила 86,20 ± 0,31%, при воздействии отрицательных температур (-20 ± 1,0 °С) — 91,40 ± 0,52%.

Предположительно криоконсервант в какой-то степени активирует тромбоциты, что сопровождается их увеличением, однако все исследуемые показатели находились в диапазоне допустимых физиологических значений, следовательно, наблюдали реакцию адаптации тромбоцитов на воздействие чужеродного компонента, в частности криоконсерванта.

В ходе проведения компьютерной цитоморфометрии тромбоцитов в группах исследований отмечали статистически значимое увеличение площади клеток по сравнению с контролем, причем более выраженное в образцах 1-й группы (с внесенным исследуемым криоконсервантом) на уровне 11,85 ± 1,15 мкм², 2-й группы (с внесенным криоконсервантом и замораживанием) — на уровне 9,12 ± 1,12 мкм². Следует отметить, что, несмотря на существенные межгрупповые различия, данный показатель отражает картину активности площади тромбоцитов с последующей адаптацией после заморозки. Отмеченные изменения находились в диапазоне физиологических референсных значений. Соответствующие данные представлены в таблице 6.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При сравнительном анализе показателей ОАК в опытных группах с внесением криоконсерванта (вне зависимости от температурных условий сохранения образцов крови) установлено достоверное снижение общего количества лейкоцитов, что, вероятно, обусловлено изменением соотношения жидкой части крови и форменных элементов в условиях введения криоконсерванта и сопряжено со снижением распознавания лейкоцитарных клеток анализатором крови. При этом было отмечено достоверное увеличение процента содержания средних клеток в образцах с температурой консервации –20 ± 1,0 °С. Вероятно, это связано с изменением морфологии лейкоцитов, на что указывают изменения в оптической плотности цитоплазмы лейкоцитов, выявленные при компьютерной цитоморфометрии. Данные изменения могут быть связаны и с эффектом влияния криоконсерванта, однако в образцах, подвергшиеся замораживанию, показатели были более стабильны.

При сравнительном анализе эритроцитарных показателей в группах с внесением криоконсерванта как в условиях положительной температуры, так и при замораживании образцов установлено достоверное снижение общего гемоглобина крови, среднего содержания гемоглобина в эритроцитах, при этом статистически значимых изменений в концентрации эритроцитов не выявлено, что говорит об эффективности примененного криопротектора. В то же время по данным компьютерной цитоморфометрии увеличение площади клетки эритроцита и тенденция к увеличению среднего диаметра клетки и фактора формы эритроцитов в образцах с криоконсервантом и последующим замораживанием подтверждает трансмембранное проникновение криоагентов внутрь клеток.

При анализе тромбоцитарных показателей установлено, что в крови с внесенным криоконсервантом (+20 ± 1,0 °С) статистически значимо снижалась концентрация тромбоцитов, что связанно с изменением соотношения клеток к жидкой части крови. Отмечено более выраженное снижение показателя в образцах, сохранявшихся в условиях отрицательных температур, по сравнению с образцами первой группы (внесенным криоконсервантом и температурой +20 ± 1,0 °С), при этом его изменения не выходили за границы физиологической нормы. Тем самым применение данного способа консервации крови может быть использовано в формировании криоконсервированного банка тромбоцитарного гемоконцентрата. При компьютерной цитоморфометрии тромбоцитарных клеток установлено статистически значимое увеличение площади клетки. Скорее всего, увеличение данного показателя объясняется тем, что тромбоцит запускает процессы активации в ответ на контакт с чужеродным агентом в виде криоконсерванта. В то же время в образцах крови 2-й группы также с внесенным криоконсервантом, но при замораживании мы регистрировали менее выраженное увеличение площади тромбоцита, что, по всей видимости, объясняется запуском процессов адаптации к криоконсерванту при воздействии отрицательных температур, однако выявленная особенность требует дальнейшего изучения.

В ходе исследования в условиях сохранения образцов крови с применением разработанного криоконсерванта после 24 ч хранения при температуре –20 °С увеличивался процент сохранности форменных элементов клеток крови (лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов: 88,6 ± 0,41, 92,1 ± 0,31, 91,4 ± 0,52% соответственно) с сохранением форменных элементов клеток крови в физиологически активном состоянии после оттаивания по сравнению с образцами крови, сохранявшимися при комнатной температуре. Необходимо отметить, что в работах Г.Ю. Кирьяновой и соавт. при использовании в качестве криоконсерванта раствора «Криосин» процент сохранности эритроцитов составил 83,80 ± 4,09 % [24]. В работах Н.В. Исаевой и соавт. при оценке жизнеспособности ядросодержащих клеток в лейкоконцентратах на этапах их получения и замораживания было отмечено, что в жизнеспособном состоянии сохраняется 86,7 % [25]. В работах К.А. Ветошкина и соавт. при замораживании тромбоцитов крови доноров под защитой комбинированного криоконсерванта сохранялась их функциональная активность, но находилась лишь в пределах 63,5—88,8 % [26]. Исследовали также форменные элементы цельной крови после суточного хранения при температуре –40 °С, при этом морфологическая и функциональная сохранность клеток составила: для эритроцитов — 85,30 ± 0,30 %, для тромбоцитов — 75,00 ± 0,71 %, для лейкоцитов — 90,10 ± 0,91 % от значений, зарегистрированных до замораживания [27].

В работах И.Г. Широких и соавт. при исследовании действия полисахаридных фракций на криоконсервированную венозную кровь человека было установлено снижение осмолярности крови человека от 281 до 149 мОсм/л, что обусловлено взаимодействием функциональных групп полисахаридов с осмотически активными веществами плазмы крови и приводило к снижению осмолярности среды и ускорению кристаллизации воды [28]. Лактулоза (как и другие дисахариды) относится к непроникающим криопротекторам, и создает осмотическое давление, которое вызывает дегидратацию клеток и уменьшает степень образования льда внутри клеток. Криоэффект лактулозы, очевидно, близок к действию дисахарида трегалозы, выполняющего функции ингибитора роста кристаллов льда в ходе замораживания и перекристаллизации льда в процессе оттаивания, образуя высоковязкое стеклоподобное состояние [29]. Тем не менее криопротекторный эффект лактулозы еще полностью не определен и нуждается в дальнейшем изучении механизма его криозащитного действия.

Основные результаты исследования нашли свое отражение в патенте на изобретение [30]. Преимуществами использования разработанного нами криопротектора являются: возможность длительного хранения без потери криопротекторных свойств, обеспечение стабилизации форменных элементов клеток крови к воздействию субумеренно низкой температуры –20 °С, приготовление криопротектора не требует громоздкого, дорогостоящего оборудования, применение нетоксичного, не проникающего внутрь клетки дисахарида лактулозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявлена морфологическая и функциональная сохранность форменных элементов крови в образцах с применением разработанного криоконсерванта после 24 ч хранения при температуре –20 °С. Разработанный криоконсервант является эффективным в условиях замораживания при –20 °С, доступным (все компоненты производятся на территории Российской Федерации), что расширяет спектр применяемых криоконсервантов для проведения анализа морфофункциональных параметров образцов замороженной цельной крови при крупномасштабных исследованиях, для полевой медицины, при хранении биоматериала в длительных экспедициях и отдаленных местностях. Работы, проводимые в таком направлении, позволят более эффективно использовать аутодонорство во избежание ряда осложнений при переливании компонентов крови.

На наш взгляд, представленные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения лактулозы в качестве криокомпонента для обеспечения сохранности клеток крови при более длительных сроках хранения.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.А. Власов — проведение экспериментов, статистический анализ данных, написание текста рукописи, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации; С.Ф. Андрусенко — планирование экспериментов, написание текста рукописи, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации; О.И. Анфиногенова — анализ и интерпретация данных; А.Б. Эльканова — анализ и интерпретация данных; А.А. Каданова — критический обзор на предмет важного интеллектуального содержания; У.Е. Сорокина — проведение экспериментов; Э.Е. Рыбчинская — проведение экспериментов; Д.А. Доменюк — участие в техническом редактировании рукописи, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.