Изучение мутационного профиля больных Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями методом NGS

ВВЕДЕНИЕ

Миелопролиферативные новообразования BCR::ABL1-негативные (Ph-МПН) представляют собой клональные гематологические злокачественные новообразования, которые характеризуются избыточным выходом зрелых миелоидных клеток в кровь и возникают из мутированной гемопоэтической стволовой клетки [1–3]. К классическим Ph-МПН относят истинную полицитемию (ИП), эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ) [4].

Открытия молекулярной генетики последних десятилетий позволили выявить общий «пусковой механизм» патогенеза этих заболеваний, а именно: постоянная активация янус-киназного (JAK-STAT) сигнального пути в клетке, посредством которого передается информация от внешних химических сигналов к ядру, приводит к транскрипции ДНК и экспрессии генов, участвующих в иммуногенезе, пролиферации, дифференцировке, апоптозе и онкогенезе [5]. Одной их причин постоянной активации JAK-STAT сигнального пути являются мутации в генах JAK2, CALR и MPL, получивших название «драйверных». Выявление мутаций в данных генах стало неотъемлемой частью современного диагностического алгоритма для пациентов с МПН, который включен в текущие клинические рекомендации. Расшифровка патогенетических механизмов развития Ph-МПН способствовала разработке и внедрению в клиническую практику таргетной терапии ингибиторов янус-киназ, блокирующих внутриклеточную сигнальную систему JAK-STAT [5].

В то же время исследования последних лет показали гетерогенность геномного ландшафта Ph-негативных МПН. Мутации выявляли в генах, отвечающих за различные функции внутри клетки: эпигенетическая регуляция метилирования ДНК (TET2, DNMT3A и IDH1/2), модификация гистонов/хроматина (ASXL1, EZH2, SUZ12), сплайсинг РНК (SRSF2, SF3B1, U2AF1), передача сигнала (SH2B3, LNK, CBL, RAS, NF1), факторы транскрипции (TP53 и RUNX1) и др. [6–9]. Выявление данных мутаций имеет диагностическое и прогностическое значение, позволяя оценить риск прогрессирования заболевания, выбрать наиболее эффективную тактику лечения и принять решение о необходимости трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Таким образом, для диагностики BCR::ABL1-негативных МПН у пациентов все большую актуальность приобретает метод секвенирования следующего поколения (next generation sequencing — NGS), позволяющий одновременно определять мутационный статус большого числа генов.

Цель исследования — оценка возможности использования метода NGS в изучении мутационного статуса пациентов с Ph-негативными МПН и анализ влияния выявленных патогенных мутаций на выживаемость пациентов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 83 пациента (30 мужчин и 53 женщины) в возрасте от 19 до 85 лет (медиана начала заболевания — 51 год), находящихся на лечении в клиниках Санкт-Петербурга и Москвы. Диагноз «Ph-негативное МПН» согласно критериям ВОЗ ранее установлен у всех больных: из них наблюдали 47 пациентов с диагнозом ПМФ, 15 больных — с диагнозом ИП, 21 человек — с диагнозом ЭТ (табл. 1).

Все пациенты были обследованы ранее на наличие мутаций в драйверных генах: у 54 (65%) человек обнаруживалась мутация в гене JAK2 (V617F), у 16 (19%) — в CALR, у 3 (4%) — в MPL. Тем не менее данные гены были включены в NGS-панель исследуемых генов и использовались в качестве внутреннего положительного контроля. Группа пациентов с ЭТ и ПМФ, не имеющих мутации ни в одном из «драйверных» генов (так называемые пациенты с тринегативным статусом), составила 10 (14,7%) пациентов от общего числа выборки.

За время наблюдения у 14 пациентов был выявлен фазовый переход или лейкемическая трансформация: у 7 пациентов с диагнозом ПМФ наблюдалась трансформация в ОМЛ; у 3 пациентов с ЭТ и 4 с ИП переход во вторичный миелофиброз (табл. 1). Выделение ДНК из образцов периферической крови проводили с использованием набора QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen, Нидерланды).

Определение мутаций в генах JAK2, MPL, CALR

Мутации в гене JAK2 определяли с помощью набора реагентов для обнаружения мутации V617F G/T гена JAK2 (Janus kinase 2) («Синтол», Российская Федерация). Мутации в генах CALR и MPL определяли методом секвенирования по Сэнгеру на генетическом анализаторе НАНОФОР-05 («Синтол», Российская Федерация). Для наработки фрагментов ДНК использовали соответствующие праймеры: MPL-F 5’-TAGCCTGGATCTCCTTGGTG-3’, MPL-R 5’-AGAGGTGACGTGCAGGAAGT-3’; CALR-F 5’-TGAGGTGTGTGCTCTGCCT-3’, CALR-R 5’-AGAGACATTATTTGGCGCGG-3.

Секвенирование следующего поколения

У всех пациентов секвенирование выполнялось с использованием таргетной экзонной панели из 118 генов со средней глубиной прочтения 1000х на приборе MiSeq (Illumina, США). Самостоятельно разработанная панель включала в себя ключевые гены, задействованные в миелоидных неоплазиях [6–9]. Для секвенирования на Illumina использовали библиотеки, приготовленные из 200 нг геномной ДНК, расщепленной до фрагментов 300 п.о., с использованием фокусированного ультразвукового аппарата Covaris S2.

Фрагментированную ДНК трансформировали в ДНК-библиотеки с помощью набора KAPA Hyper Prep Kit (Roche, Швейцария). Обогащение ДНК-библиотек проводили с помощью набора Hyper Cap Target Enrichment и набора KAPA Hyper Exome Probes (Roche, Швейцария) согласно протоколу производителя. Для приготовления библиотек ДНК использовали модуль MGIEasy Circularization Module V2.0 (MGI, Китай). Количественный анализ библиотеки проводили на флуориметре Quantus с набором QuantiFluor® dsDNA System (Promega, США).

В качестве средства просмотра анализов секвенирования использовали программное обеспечение Illumina Sequence Analysis Viewer. Качество исходных данных NGS оценивалось с помощью программного обеспечения FastQC в Illumina BaseSpace Sequence Hub. Данные секвенирования были проанализированы с использованием комбинации двух приложений для выравнивания последовательностей и вызова вариантов, также применяемых в Illumina Bas eSpace Sequence Hub: приложения DNA Amplicon и приложения Pindel, с пределом обнаружения частоты аллелей 3% (VAF).

Клиническая значимость мутаций устанавливалась по базам данных COSMIC, ClinVar и Franklin согласно критериям ACMG/AMP. Для аннотации функции генов была использована база KEGG.

Для анализа выживаемости применяли метод Каплана — Мейера с оценкой статистической значимости с помощью теста Кокса — Мантела. Статистический анализ выполнялся с помощью GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, La Jolla, CA, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мутационный статус драйверных генов

По крайней мере одна из драйверных мутаций в генах JAK2, CALR и MPL была выявлена у 72 (87%) пациентов из общего числа больных с диагнозом «Ph-негативное МПН», принимавших участие в исследовании, что соответствует данным, полученным иными молекулярными методами.

В ходе исследования у 27 (57,5%) пациентов с диагнозом ПМФ обнаруживалась мутация в гене JAK2 (V617F), мутация в гене CALR — у 12 (25,5%), у 2 (4,2%) пациентов — мутация в гене MPL, у 6 (12,8%) пациентов не были выявлены мутации в драйверных генах (так называемый «тринегативный» статус). У всех 15 пациентов с диагнозом ИП определялась мутация в гене JAK2 (V617F). В гене JAK2 определялась только мутация в 14-м экзоне (V617F), мутации в 12-м экзоне выявлены не были. В гене MPL мутации обнаруживались только в положении W515. В гене CALR были выявлены мутации двух основных типов: делеция 52 нуклеотидов и инсерция 5 нуклеотидов.

При проведении исследования у 12 (57%) из 21 пациента с диагнозом ЭТ выявлялась мутация в гене JAK2 (V617F), мутацию в гене CALR регистрировали у 4 (19%) больных, у 1 (5%) пациента была определена мутация в гене MPL, в то же время 4 (19%) пациента имели тринегативный статус.

Мутационный профиль исследуемой когорты пациентов

При NGS исследовании 118 генов мутации были выявлены у 39 (46%) из 83 пациентов в 23 генах, представленных на рисунке 1. При этом одну патогенную мутацию имели 19 (49%) из 39 наблюдаемых пациентов, 2 мутации регистрировали у 7 (18%) больных, 3 и более мутаций отмечены у 13 (33%) пациентов с Ph-негативными МПН. В среднем у всей когорты выявлялась 1 патогенная мутация.

В анализируемой выборке пациентов патогенные мутации выявлялись чаще других в генах ASXL1 и TET2: у 25 и 15% пациентов соответственно. Мутации в генах SRSF2 и IDH1/2 обнаруживались у 8% пациентов, DNMT3A — у 6%, U2AF1, PHF6, TP53 — у 4% каждая, APC, EZH2, SF3B1, KRAS — у 3% каждая. Мутации в генах ATRX, CBL, DDX3X, EP300, GATA2, RUNX1, SETBP1, SUZ12, ZRSR2 обнаруживались всего у 1% пациентов каждая (рис. 1).

Среди пациентов с тринегативным статусом были выявлены патогенные мутации у 8 (80%) из 10 пациентов в 7 различных генах. При этом у 4 из них была обнаружена лишь одна мутация, у 2 пациентов две мутации, у 2 пациентов три патогенных мутации одновременно. В двух генах сочетанно SRSF2 и ASXL1 мутации были выявлены у 4 пациентов с тринегативным статусом, у 2 пациентов детектировали мутацию в гене IDH1, у 1 больного — в генах RUNX1, TET2, NF1 и HRAS.

В ходе исследования были обнаружены патогенные мутации в 23 генах, которые дополнительно анализировали с помощью базы данных KEGG, позволяющей предсказать функции данных генов. Большинство генов (SRSF2, U2AF1, SF3B1, PHF6, DDX3X, ZRSR2) участвуют в сплайсинге РНК и метилировании ДНК (DNMT3A, IDH1, IDH2, TET2, SUZ12). Меньшее количество генов отвечают за модификацию хроматина (гистонов), репликацию ДНК и передачу сигналов внутри клетки; три гена выполняют роль транскрипционных факторов (табл. 2). Малый размер выборки пациентов, включенных в наше исследование, не позволил оценить влияние каждой функциональной группы на прогноз течения заболевания или эффективность терапии лечения. Тем не менее анализ с помощью базы данных KEGG способствовал пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе Ph-негативных миелопролиферативных новообразований.

Генетические маркеры лейкемической трансформации

В ходе исследования у 14 пациентов с фазовым переходом во вторичный миелофиброз или с лейкемической трансформацией обнаруживали в среднем 2 патогенные мутации. При этом мутации в гене ASXL1 были выявлены у 9 (64%) больных, у 3 (22%) пациентов обнаруживались мутации в генах IDH1,2, DNMT3A, TET2, у 2 (14%) — мутации детектировались в генах SRSF2, SFR3B1, TP53, у 1 (7%) пациента выявлена мутация в генах KRAS, SUZ12, PHF6.

Влияние выявленных мутаций на бессобытийную выживаемость пациентов

В исследовании было показано значимое влияние мутационного профиля генов на показатели бессобытийной выживаемости пациентов. Так, мутации в гене ASXL1 статистически значимо ассоциировались (p = 0,0011) со снижением бессобытийной выживаемости (медиана — 11,8 и 15,75 года) (рис. 2) в исследуемой когорте пациентов.

При анализе данных, представленных на рисунке 3, установлено, что сочетание драйверной и любой из патогенных мутаций (группа драйверная+, патогенная+) статистически значимо связано со снижением бессобытийной выживаемости по сравнению с группой пациентов, у которых выявлены исключительно драйверные мутации (группа драйверная+, патогенная–), (медиана выживаемости — 10,0 и 15,8 года). Наихудший прогноз был показан для пациентов с тринегативным статусом и наличием хотя бы одной патогенной мутации (группа драйверная–, патогенная+), (медиана выживаемости — 6,9 года). Для группы пациентов, у которых не выявляли ни патогенные, ни драйверные мутации (драйверная–, патогенная–), медиана достигнута не была.

На рисунке 4 показано, что наличие двух и более мутаций также ассоциировалось с достоверным снижением бессобытийной выживаемости (p < 0,0001) (медиана выживаемости — 7 и 13,17 года) по сравнению с пациентами с меньшим количеством патогенных мутаций. Анализ данных NGS показал, что большее количество патогенных мутаций связано с ухудшением прогноза выживаемости.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В основе патогенеза Ph-негативных миелопролиферативных новообразований лежат мутации в драйверных генах — JAK2, CALR и MPL. Выявление мутаций в данных генах на сегодняшний момент — основа молекулярной диагностики пациентов с подозрением на Ph-негативное МПН. Между тем исследования последних лет показывают, что генетический ландшафт классических Ph-негативных МПН не ограничивается только мутациями в драйверных генах. Значительное число мутаций в различных генах было описано как патогенные для Ph-негативных МПН, оказывающие влияние на фенотип, течение и прогноз заболевания. Быстрое и достоверное выявление таких мутаций в широком спектре генов невозможно рутинными лабораторными методами. В этой связи все большее применение находит метод NGS, который позволяет с высокой точностью и чувствительностью одновременно определить мутации в большом количестве генов.

В настоящий момент как в научной, так и клинической практике диагностику пациентов с Ph-негативными МПН методом NGS проводят с использованием различных индивидуальных и коммерческих панелей генов [9–12]. В нашем исследовании впервые мутационный статус пациентов с Ph-негативными МПН изучен с помощью персонализированной панели из 118 генов. Данная панель включает в себя не только гены, ассоциированные с Ph-негативными МПН, но и гены, мутации в которых выявляются при других типах миелоидных новообразований. Секвенирование было проведено у 83 Ph-негативных пациентов с МПН. Анализ данных показал, что мутации в генах JAK2, MPL и CALR, выявленные у пациентов стандартными лабораторными методами, успешно обнаруживаются в наших условиях методом NGS. Этот факт свидетельствует о надежности полученных данных секвенирования.

В нашем исследовании в дополнение к драйверным генам мутации, определяемые как патогенные, были выявлены у 39 пациентов в 23 (20%) генах из 118 исследуемых. По сравнению с результатами, полученными в исследовании авторов [13], при анализе группы из 197 пациентов методом NGS с использованием таргетной панели патогенные мутации были найдены у 35% больных. При этом мутации были выявлены в 27% генов из 104 анализируемых. Различия в количестве мутировавших генов (20% и 27%) от общего их числа можно объяснить разным набором генов, используемых в таргетных панелях в нашей работе и исследованиях Lundberg et al. [13].

Наиболее часто дополнительные патогенные мутации у пациентов с различными МПН встречаются в гене ASXL1 [8]. Мы обнаружили, что 25% пациентов имели мутацию именно в данном гене. Частота выявления мутаций в гене ASXL1 варьирует при различных Ph-негативных МПН. Так, по данным исследователей [14–19], при первичном миелофиброзе мутации были обнаружены в 23–25% случаев, при эссенциальной тромбоцитемии — в 5–20%, при истинной полицитемии частота мутаций в гене ASXL1 составила 3,5–11,8%. В нашем исследовании данные мутации были обнаружены у 26,6% пациентов с ПМФ, у 14,2% больных с ЭТ и 16% пациентов с ИП.

При клональной эволюции МПН предполагаются два пути мутагенеза с участием гена ASXL1:

• патогенные мутации могут возникать вслед за драйверными мутациями в генах JAK2 и CALR при ПМФ;
• могут быть первичным пусковым событием, предшествующим драйверным мутациям [20–22].

Многие исследования показывают влияние мутаций в гене ASXL1 на общую и бессобытийную выживаемости и тромботические события у пациентов с Ph-негативными МПН [23][24]. Однако Guglielmelli et al. установили, что мутации в гене ASXL1 снижают общую выживаемость у пациентов с ПМФ, но не с вторичным МФ [25]. Кроме того, мутации в ASXL1 оказывают влияние на результаты терапии таргетными препаратами и алло-ТГСК [26]. В нашем исследовании мы показали ассоциацию драматического снижения бессобытийной выживаемости (медиана выживаемости 7,83 против 15,75 года, р = 0,0011) для всех пациентов с мутациями и без в данном гене.

Достижения генетики и молекулярной биологии последних лет позволили более полно описать генетический ландшафт Ph-негативных МПН и выявить гены, мутации в которых оказывают негативное влияние на прогноз: ASXL1, EZH2, IDH1, IDH2, SRSF2 и U2AF1Q157. Такие мутации получили название «мутации высокого риска» и были включены в различные прогностические шкалы. Количество мутаций в данных генах также влияет на прогноз, а именно: 1 патогенная мутация сокращала медиану общей выживаемости больных в 1,7 раза, 2 мутации — в 4,7 раза по сравнению с пациентами без мутаций в этих генах (Me = 12,2, Me = 7,0 , Me = 2,6 года соответственно, p < 0,0001) для пациентов с миелофиброзом [27].

В нашем исследовании с использованием панели из 118 генов мы показали, что не только мутации высокого риска оказывали влияние на выживаемость пациентов с МПН, но и любые патогенные варианты мутаций в сочетании с драйверными генами (p = 0,0004) существенно снижали ее; при этом важным является не только сам факт наличия данного варианта сочетания, но и количество таких вариантов. У пациентов с двумя и более мутациями значительно снижалась бессобытийная выживаемость по сравнению с пациентами с одной мутацией (p < 0,0001). Таким образом, при диагностике Ph-негативного МПН важно не ограничиваться определением мутационного статуса только 6 генов высокого молекулярного риска, но анализировать как можно более широкие панели.

Недавние исследования продемонстрировали важность NGS метода для описания мутационного профиля пациентов с тройным негативным статусом [28][29]. Действительно, у 8 из 10 таких пациентов из изучаемой нами когорты были выявлены патогенные мутации в различных генах. Обнаружение мутаций у данной группы пациентов позволило подтвердить клональность и оценить риски течения заболевания. Важно отметить, что отсутствие драйверных и патогенных мутаций у пациентов с подтвержденным диагнозом Ph-негативного МПН позволяет выделить их в отдельную когорту с наиболее благоприятным прогнозом течения заболевания без лейкемической трансформации [12]. Не во всех исследованиях, однако, удается выделить такую группу. Так, Huang et al. выявили патогенные мутации у всех 12 пациентов с тринегативным статусом [12].

Метод NGS является удобным инструментом как для оценки прогноза заболевания, так и для выбора генов-мишеней таргетной терапии, направленной не только на драйверные, но и на гены с различным функционалом (например, IDH1,2 и EZH2). Мутации в данных генах были выявлены и у пациентов из нашей когорты. При этом гены IDH1,2 были мутированы у 8% пациентов, а EZH2 — у 3% пациентов, что соответствует данным, полученным другими исследователями с помощью стандартных молекулярных методов [8][30].

Соматические мутации в широком спектре генов выявляются у 80% пациентов с ПМФ и у 50% пациентов с ЭТ/ИП и оказывают влияние на течение и прогноз заболевания [29]. В нашей группе пациентов мы обнаружили патогенные мутации, влияющие на прогноз течения заболеваний, у 46% больных с ПМФ, в том числе и у пациентов с лейкемической трансформацией. К факторам риска, повышающим вероятность лейкемической трансформации, среди прочего, относят мутации в различных генах: IDH1, IDH2, SRSF2, ASXL1 при первичном миелофиброзе, в генах SRSF2, IDH2 или RUNX1 при истинной полицитемии, в генах TP53, SRSF2, EZH2, U2AF1 или RUNX1 при эссенциальной тромбоцитемии. При этом было показано, что время до лейкемической трансформации сокращается с увеличением количества патогенных мутаций у пациентов с Ph-негативными МПН (p < 0,0001), что коррелирует с полученными нами данными о большем количестве мутаций у пациентов с трансформацией заболеваний [12].

Обнаружение драйверных мутаций стало прорывным открытием в диагностике миелопролиферативных новообразований, что помогло в определении патогенеза этих заболеваний. Сейчас внедрение метода NGS значительно изменяет восприятие и подход к диагностике, оценке риска и лечению пациентов с Ph-негативными МПН. Благодаря возможности одновременного поиска мутаций во многих генах NGS позволяет не только устанавливать диагноз и подтверждать клональность заболевания, но и выявлять группы пациентов с неблагоприятным прогнозом и повышенным риском прогрессирования и трансформации заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, применение метода NGS с использованием панели из 118 генов при диагностике больных Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями позволило изучить мутационный профиль заболевания, подтвердить клональность заболевания у пациентов с тринегативным статусом, выявить патогенные мутации, значимо влияющие на результаты терапии пациентов.

В нашем исследовании патогенные мутации выявлялись практически у половины пациентов с Ph-негативными МПН в 23 генах. Снижение бессобытийной выживаемости было показано для больных с сочетанием драйверной и патогенной мутаций. Две и более патогенные мутации у одного пациента сокращали бессобытийную выживаемость по сравнению с пациентами с одной мутацией. Наиболее частым молекулярным событием при Ph-негативных МПН являлись мутации в гене ASXL1, ассоциирующиеся со снижением бессобытийной выживаемости больных. Комплексный подход к диагностике Ph-МПН с применением современных молекулярно-генетических технологий позволит устанавливать диагноз, оценивать прогностические особенности течения заболевания и подбирать наиболее эффективную персонализированную терапию.