Оптимизация начального этапа культивирования клеточных линий Vero и НЕК293

Введение. Наработка в лабораториях вирусного материала в малых количествах, как правило, проводится с использованием адгерентных линий и культуральных флаконов различной площади. Необходимость увеличения выхода продукта приводит или к увеличению количества флаконов, или смене системы накопления, например на роллерные бутыли. Одним из факторов, оказывающих влияние на эффективность адгезии клеток и формирование однородного монослоя, является частота вращения роллерной бутыли. При этом отмечено небольшое количество исследований, касающихся оценки влияния частоты вращения и определения ее оптимального показателя, особенно на основе морфологии клеток.

Цель. Оптимизировать начальный этап роллерного культивирования клеточных линий Vero и HEK293 с учетом влияния частоты вращения роллерной бутыли на прикрепление клеток при посеве и формирование монослоя.

Материалы и методы. Для проведения экспериментальной работы были использованы 2 монослойные клеточные линии: Vero и HEK293. Посевные концентрации были взяты из паспортов клеточных линий и составляли 4×10⁴ кл/см². Клеточную линию засевали на роллерные бутыли и культивировали согласно диапазону частот вращения 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 и 0,6 об/мин с использованием роллерной установки Celrol Mid, Wiggens в СО₂-инкубаторе D180, RWD. Через 1, 2 и 3 сут культивирования оценивали качество прикрепления клеток к ростовой поверхности и формирование монослоя путем просмотра под микроскопом ТС5400, Meiji Techno. результаты. При культивировании клеточной линии Vero частота вращения до 0,6 об/мин не оказывала значительного влияния на адгезию клеток к поверхности. Наиболее равномерное расположение клеток наблюдали при частоте вращения 0,4–0,5 об/мин. Культура клеток НЕК293 более чувствительна к механическим воздействиям питательной среды, и при частоте вращения свыше 0,2 об/мин наблюдали атипично округлые формы клеток и нарушение полноценного их прикрепления к ростовой поверхности. При этом дальнейшее культивирование на данной частоте вращения не приводило к формированию однородного монослоя из-за медленного чередования «фазы дыхания» и «фазы питания». Следовательно, после прикрепления клеток к поверхности необходимо увеличение частоты вращения роллерной бутыли.

Выводы. Для клеточной линии Vero оптимальной частотой вращения является 0,4–0,5 об/мин, для клеточной линии HEK293 в первые сутки необходимо устанавливать 0,2 об/мин, а через сутки увеличить до 0,5 об/мин. Апробированные условия культивирования позволяют выращивать данные клеточные линии для наработки вирусной биомассы.

1. Shen CF, Guilbault C, Li X, Elahi SM, Ansorge S, Kamen A, et al. Development of suspension adapted Vero cell culture process technology for production of viral vaccines. Vaccine. 2019;37(47):6996–7002. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.07.003

2. Sеne M-A, Xia Y, Kamen AA. Overview of recent advances in Vero cells genomic characterization and engineering for high-throughput vaccine manufacturing. Clinical and Translational Discovery. 2022;2(2):1–6. https://doi.org/10.1002/ctd2.40

3. Kiesslich S, Kamen А. Vero cell upstream bioprocess development for the production of viral vectors and vaccines. Biotechnology Advances. 2020;44:1–9. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2020.107608

4. Malm M, Saghaleyni R, Lundqvist M, Giudici M, Chotteau V, Field R, et al. Evolution from adherent to suspension: systems biology of HEK293 cell line development. Scientific Reports. 2020;10:18996. https://doi.org/10.1038/s41598-020-76137-8

5. Tan E, Chin CSH, Lim ZFS, Ng SK. HEK293 Cell Line as a Platform to Produce Recombinant Proteins and Viral Vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021;9:796991. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.796991

6. Морозов АН, Яхин ИР, Стратонова НВ, Куцкир МВ, Потеряев ДА, Хамитов РА. Опыт масштабирования и интенсификации промышленного производства векторной аденовирусной вакцины Гам-КОВИД-Вак в лимитирующих условиях пандемии. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(4):382–91. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-4-382-391

7. Ишмухаметов АА. Фундаментальные и прикладные науки, технология и иммунобиологический продукт. Вестник Российской академии наук. 2022;92(8):717–21. https://doi.org/10.31857/S0869587322080059

8. Бабак ВА, Ломако ЮВ, Гусев АА, Чаплыго КЭ, Пунтус ИА, Филипкова АЕ. Оптимальные режимы культивирования линии клеток ВНК-21 (с-13). Ученые записки учреждения образования «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины». 2011;47(2–1):7–11. EDN: SHRRRD

9. Рябова ЕИ, Деркаев АА, Есмагамбетов ИБ, Щебляков ДВ, Довгий МА, Бырихина ДВ и др. Сравнение различных технологий получения рекомбинантного аденоассоциированного вируса в лабораторном масштабе. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2021;21(4):266–78. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2021-21-4-266-278

10. Bellani CF, Ajeian J, Duffy L, Miotto M, Groenewegen L, Connon CJ. Scale-Up Technologies for the Manufacture of Adherent Cells. Frontiers in Nutrition. 2020;7:575146. https://doi.org/10.3389/fnut.2020.575146

11. Седова ЕС, Щербинин ДН, Банделюк АС, Верховская ЛВ, Вискова НЮ, Авдонина ЕД, и др. Способ получения рекомбинантных антител, продуцируемых клеточной линией, трансдуцированной рекомбинантными аденовирусами. Тонкие химические технологии. 2023;18(1):48–64. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2023-18-1-48-64

12. Yang J, Guertin P, Jia G, Lv Z, Yang H, Ju D. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. Applied and Industrial Microbiology. 2019;9(70):1–14. https://doi.org/10.1186/s13568-019-0794-5

13. Решетникова ОВ. Биотехнология культивирования вирусов. Актуальные вопросы теории и практики современной биотехнологии. 2015:155–61. EDN: XDGYLH

14. Alexander MH. In vitro expansion of postpartum-derived cells in roller bottles. Patent of United States No. 8741638B2; 2014.

15. Генералов СВ, Абрамова ЕГ, Матвеева ЖВ, Жулидов ИМ, Савицкая ЛВ, Лобовикова ОА. Оптимизация условий масштабированного культивирования фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в культуре клеток Vero. Проблемы особо опасных инфекций. 2014;2:101–3. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2014-2-101-103

16. Liu YL, Wagner K, Robinson N, Sabatino D, Margaritis P, Xiao W, et al. Optimized Production of High-Titer Recombinant Adeno-Associated Virus in Roller Bottles. BioTechniques. 2003;34(1):184–9. https://doi.org/10.2144/03341dd07

17. Chisti Y. Hydrodynamic Damage to Animal Cells. Critical Reviews in Biotechnology. 2001;21(2):67–110. https://doi.org/10.1080/20013891081692

18. Chang HY, Kao WL, You YW, Chu YH, Chu KJ, Chen PJ, et al. Effect of surface potential on epithelial cell adhesion, proliferation and morphology. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2016;141:179–86. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2016.01.049