Оптимизация начального этапа культивирования клеточных линий Vero и НЕК293

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время подавляющее большинство биотехнологических процессов основано на использовании адгерентных линий клеток, таких как MRC5, Vero, MDCK и HEK293, в качестве субстратов для накопления вирусов [1].

Линия клеток Vero была получена в 1962 году из клеток почек самки африканской зеленой мартышки и является перевиваемой клеточной линией, подходящей для продолжительного культивирования без приобретения туморогенных свойств [2]. В связи с низким уровнем экспрессии интерферона и биологической безопасностью данная клеточная линия является первой клеточной линией, одобренной Всемирной организацией здравоохранения для использования в качестве субстрата для вакцин и не теряющей с тех пор своей значимости [3].

Клеточная линия НЕК293 представляет иммортализированные клетки почки из абортированного эмбриона человека фрагментом генов аденовируса 5. В связи с этим использование НЕК293 в качестве субстрата — накопителя рекомбинантных белков, требующих посттрансляционных модификаций, особенно актуально. Наличие встроенных генов E1A и E1B в 19 хромосому позволяет получать рекомбинантные аденоассоциированные частицы. В отличие от клеточной линии Vero, НЕК293 склонна к геномной нестабильности [4][5].

Потребность в быстром получении большого объема биомассы субстрата накопления антигена может быть связана с рядом причин как экономического, так и социального характера. Пандемия SARS-CoV-2 наглядно показала такую острую необходимость, когда потребность в больших количествах разработанных, в том числе de novo, профилактических биопрепаратах приобрела первостепенную значимость [6][7].

Одной из основных задач при использовании монослойных клеточных линий в промышленных масштабах является увеличение количества получаемой биомассы клеток [8]. Существуют 4 способа выращивания больших объемов клеточных культур: стационарный [9], динамичный [10], суспензионный [10][11] и использование микро- и макроносителей [10][12].

Преимуществами роллерного (динамичного) способа культивирования по сравнению с другими являются:

• экономичное использование питательной среды и других реагентов при более высоком титре получаемого вируссодержащего материала на единицу объема по сравнению с культивированием в матрасах и клеточных фабриках: увеличение площади ростовой поверхности в несколько раз обусловлено ребристыми стенками сосуда при сохранении относительно компактного размера культуральной бутыли и незначительном увеличении объема используемой среды; производителем рекомендовано заполнение роллерной бутыли (1900 см²) 300–400 мл питательной среды, а в роллерном флаконе такого же объема, но с гладкими стенками (площадью 850 см²) — до 250 мл, таким образом более чем двукратное увеличение площади приводит к увеличению объема среды менее чем в 1,5 раза;
• меньшая стоимость необходимого оборудования для получения биомассы, особенно при использовании роллерных установок, которые помещаются в стандартный СО₂-инкубатор или термостат, по сравнению с системами культивирования с использованием биореакторов и микроносителя;
• количество выполняемых персоналом операций при работе с роллерами соответствует количеству при работе с культуральными матрасами, но при этом площадь ростовой поверхности значительно больше [13].

Несмотря на то что частота вращения является одним из важнейших факторов, влияющих на прикрепление клеток и формирование монослоя [14], исследований по данной теме недостаточно. В рамках разработки методики культивирования вируса бешенства на клеточной культуре Vero с использованием роллерных бутылей приведены данные, которые указывают на косвенную связь между частотой вращения и качественной адгезией клеток к ростовой поверхности, не оценивая при этом изменение морфологии клеток на этапах культивирования, а только используя индекс пролиферации. Приведенное исследование скорее отражает оценку влияния частоты вращения на итоговое количество клеток и интенсивность деления клеток [15]. Для клеточной линии НЕК293 упомянут конкретный протокол культивирования: 0,25 об/мин с последующей сменой до 1 об/мин для проведения трансфекции аденоассоциированным вирусом, причем не указаны обоснования изменения диапазона частот вращения [16].

Следует отметить, что сведения об определении оптимальной частоты вращения при культивировании, ее влиянии на адгезию клеток на начальном этапе роста, а также на увеличение роста биомассы клеток и ее итоговое количество представлены ограниченно.

Цель работы — оптимизация начального этапа роллерного культивирования клеточных линий Vero и HEK293 с учетом влияния частоты вращения роллерной бутыли на прикрепление клеток при посеве и формировании монослоя.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали клеточные линии НЕК293 и Vero, предоставленные Институтом синтетической биологии и генной инженерии ФГБУ «ЦСП» ФМБА России. В качестве сосуда для культивирования применяли роллерные бутыли с площадью ростовой поверхности 2125 см² (максимальный объем 2300 мл, диаметр 122 мм, ребристые стенки, TC-treated полистирол; производитель Greiner) и культуральные флаконы с площадью 175 см² (TC-treated полистирол, ServiceBio, Китай).

В качестве питательной среды для клеточной линии НЕК293 была применена среда Игла, модифицированная по Дульбекко (ServiceBio, Китай), с добавлением 10 мл антибиотика пенициллин-стрептомицина («ПанЭко», Российская Федерация) на 1 л готовой среды, 1% по объему раствор GlutaMAX (Gibco, Великобритания) и 10% фетальная бычья сыворотка (Capricorn, Великобритания).

Для клеточной линии Vero использовали среду Игла с солями Эрла («ПанЭко», Российская Федерация) с добавлением 1% гентамицина сульфата («ПанЭко», Российская Федерация), 146 мг глутамина («ПанЭко», Российская Федерация) и 7,5% заменителя сыворотки эмбриональной FetalClone III (HyClone, Соединенные Штаты Америки).

Итоговое количество клеток определяли с использованием счетчика и анализатора жизнеспособности клеток C200FL RWD (Life Science, Китай). Предварительно клетки диссоциировали 0,25% раствором трипсина («ПанЭко», Российская Федерация) и ресуспензировали в питательной среде, состав которой описан ранее для каждой из культур клеток. Пробу клеточной суспензии разводили с 0,4% трипановым синим (AbiDye, Российская Федерация) в соотношении 1:1. Подсчет производили трижды и высчитывали среднее значение концентрации клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе работы при культивировании клеточной линии Vero на частоте вращения роллерной бутыли 0,2–0,5 об/мин на 1 сут адгезия клеток наблюдалась во всех исследуемых роллерных бутылях: более 90% посеянных клеток прикрепились, при частоте вращения 0,6 об/мин клетки в меньшей степени прикреплялись к ростовой поверхности пластика, в результате чего монослой не соответствовал критериям качества из-за его неоднородности и невозможности использования для наработки вирусного материала. Критерии качества включали наличие полноценного монослоя клеток без выраженной зернистости в светлом поле микроскопа, отсутствие дефектов на поверхности монослоя и многослойного роста клеток с заполнением пространства для роста. Такого рода высокая способность к адгезии клеток обусловлена достаточно высокой экспрессией интегринов и связана с особенностями тканевого происхождения: клетки эпителиальной ткани плотно располагаются между собой и образуют слои.

Клетки сохраняли типичную морфологию в соответствии с изображением в паспорте клеточной линии. Хотя тенденция к формированию монослоя наблюдалась на частотах вращения 0,2–0,5 об/мин, на 2 и 3 сут культивирования при частоте вращения 0,2 об/мин на его поверхности было отмечено довольно большое образование конгломератов клеток. При частоте вращения в диапазоне 0,3–0,4 об/мин количество конгломератов клеток на поверхности монослоя снижалось пропорционально увеличению частоты вращения. При этом на частоте вращения 0,5 об/мин замечено, что конгломераты клеток не находятся на поверхности, а плавают в толще среды. Данное явление показывает, что при увеличении частоты вращения (более быстрое чередование «фазы питания» и «фазы дыхания») создаются более оптимальные условия для роста клеток, однако при скорости вращения свыше 0,5 об/мин поток культуральной среды, индуцированный силой гравитации и вращением роллерной установки, может затрагивать конгломераты клеток, которые затем открепляются от поверхности.

Для наибольшей наглядности нами сделаны фотографии клеток линии Vero при частоте вращения роллерной установки 0,5 об/мин, отражающие процесс формирования монослоя при культивировании (рис. 1). Цветовой фон у фотографий отличается в связи с различной настройкой светодиода (встроенного блока светофильтров) у используемого микроскопа при фотографировании, а также из-за изменения цвета фенолового красного в составе питательной среды при кислом рН.

На рисунке 1 представлено изображение клеток через 5 ч после засева, которые в большей степени уже прикрепились к ростовой поверхности пластика и приобрели типичную полигональную морфологию.

На рисунке 2 представлен процесс формирования монослоя в процессе культивирования. Наблюдали постепенное заполнение клетками ростового пространства и уплотнение межклеточных контактов в связи с ограниченным пространством для роста.

В связи с тем что поверхность роллера ребристая и наблюдается размытие фокуса ближе к краям поля зрения, показать развивающийся монослой полностью в 1 кадре не представляется возможным.

После культивирования в течение 3 сут был получен плотный монослой с конфлюентностью более 90% (рис. 3), при этом скопления конгломератов клеток и признаков деградации монослоя не наблюдалось.

Таким образом, частота вращения роллерной бутыли 0,4–0,5 об/мин обеспечивала нормальный рост клеточной культуры ввиду того, что формирование монослоя было сопряжено с наименьшим образованием конгломератов клеток. Клетки прикреплялись и росли более равномерно, а формирующийся монослой не деформировался. Согласно данным литературы [15], клетки действительно лучше прикрепляются на частоте вращения в диапазоне 0,4–0,5 об/мин и увеличения частоты вращения после начала формирования монослоя не требуется. При культивировании клеточной линии Vero в диапазоне значений рН от 7,0 до 7,4 значимых различий в адгезии клеток к ростовой поверхности не отмечено. Колебания температуры в пределах ±2 °С от стандартной (37 °С) при культивировании клеточной линии Vero также не оказывали значительного влияния на прикрепление клеток.

Для клеточной линии НЕК293 при посеве наблюдали адгезию на частоте вращения от 0,1 до 0,4 об/мин, что указывало на меньшую способность клеток к адгезии по сравнению с клеточной линией Vero и бóльшую чувствительность к механическим внешним воздействиям вследствие генетических особенностей и иной тканевой принадлежности. На частоте вращения 0,2 об/мин клетки соответствовали типичной морфологии: уплощенная, слегка вытянутая форма с наблюдаемыми отростками (рис. 4).

При культивировании клеток линии НЕК293 в течение 6 ч на частоте вращения роллерной бутыли 0,4 об/мин клетки приобретали атипичную морфологию (рис. 5). Их форма оставалась округлой, несмотря на прикрепление к ростовой поверхности, и при делении в дальнейшем формировались небольшие точечные скопления клеток. Предположительно данное явление связано с достаточно сильным механическим воздействием культуральной среды, которая под действием сил гравитации при вращении роллерной установки оказывает влияние на клеточную оболочку и дестабилизирует связь между структурами на ее поверхности и химическими группами культурального пластика [17][18].

В то же время при культивировании в течение 5 ч клеток линии НЕК293 и вращении роллерной бутыли на частоте 0,5 об/мин прикрепилось менее 50% от количества засеянных клеток, при этом большая их часть имела округлую форму, аналогичную клеткам, полученным при частоте вращения роллерной бутыли более 0,2 об/мин (рис. 6). Это также объясняется достаточно сильным влиянием внешних механических сил при вращении роллерной бутыли на форму клетки и возможность ее прикрепления к ростовой поверхности. При повышении частоты вращения до 0,6 об/мин адгезии клеток к поверхности не наблюдалось.

В связи с тем что частота вращения роллерной бутыли 0,2 об/мин обеспечивала наилучшее прикрепление клеток к ростовой поверхности с сохранением их морфологии, формирование монослоя отслеживали в этих условиях.

При выращивании клеточной линии НЕК293 при температуре 37 ± 2 °С и частоте вращения 0,2 об/мин в течение 1 и 2 сут наблюдали тенденцию к образованию монослоя (рис. 7). Несмотря на активные ростовые процессы, на оставшейся поверхности культурального пластика не происходило формирования полноценного монослоя, вместе с тем наблюдался многослойный рост клеточной культуры.

Цветовой фон у фотографий отличается из-за изменения цвета фенолового красного в составе питательной среды при закислении рН. В связи с тем что поверхность роллера ребристая и наблюдается размытие фокуса ближе к краям поля зрения, показать развивающийся монослой полностью в 1 кадре не представляется возможным.

На 3 сут при постоянной частоте вращения роллерной установки 0,2 об/мин формирования полноценного монослоя не отмечали; одновременно с этим наблюдали участки, не занятые клеточной биомассой. Частично на некоторых участках возникли очаги многослойного роста клеток с резко очерченными границами между монослоем и ростовой поверхностью пластика. В небольшом количестве отмечены клетки, открепившиеся от поверхности и плавающие в питательной среде; соответствующие данные представлены на рисунке 8.

Поэтому было проведено увеличение частоты вращения роллерной установки до 0,5 об/мин после полноценного прикрепления клеток к ростовой поверхности пластика для более быстрой смены «фазы питания» и «фазы дыхания», поскольку при медленной смене в «фазе дыхания» клетки могли высыхать и отмирать в дальнейшем, что и приводило к дефектам в монослое. Затем в местах гибели клеток контактное ингибирование прекращалось между ними без непосредственного физического контакта, вследствие этого ростовые и митотические процессы в клетках активизировались вновь. Установлено, что величина частоты вращения роллерной бутыли 0,5 об/мин являлась наиболее оптимальной для выращивания клеток.

Также нами было определено, что оптимальное увеличение частоты вращения на 2 сут культивирования после посева клеток составляет не выше 0,5 об/мин, иначе повышается риск деформирования формирующегося монослоя в результате сильного механического воздействия, возникающего при вращении роллерной установки и гравитационного перемещения питательной среды. Представленные данные свидетельствуют о том, что при культивировании клеточной линии НЕК293 требуется смена скоростей вращения роллерной установки для получения однородного монослоя.

Результатом культивирования в предлагаемых нами условиях при температуре 37 ± 2 °С в течение 1 сут частота вращения составляет 0,2 об/мин, на 2 сут необходимо увеличение частоты вращения до 0,5 об/мин для получения полноценного качественного монослоя, формирование которого при культивировании с изменением частоты вращения показано на фото ниже (рис. 9). Монослой представлен клетками с характерной уплощенной формой, возникающей при прикреплении к ростовой поверхности; также наблюдали тенденцию к формированию крупных участков роста клеток.

В течение первых суток культивирования при частоте вращения роллерной бутыли 0,2 об/мин клетки прикреплялись к ростовой поверхности и формировали участки роста клеточной культуры (рис. 9А). После смены частоты вращения роллерной бутыли до 0,5 об/мин наблюдали активный рост клеток по всей ростовой поверхности (рис. 9Б) без участков с многослойным ростом клеток или резкими границами между скоплениями клеток и пластиком.

На 3 сут культивирования при частоте вращения 0,5 об/мин сформировался плотный монослой, визуально однородный, без очагов многослойного роста клеток и открепившихся клеток от поверхности (рис. 10).

Анализ данных условий культивирования клеточной линии НЕК293 показал, что значения рН в диапазоне 7,0–7,4 и колебания температуры в пределах ±2 °С от стандартной не оказывали существенного значимого влияния на процессы адгезии клеток к ростовой поверхности.

Полученные нами результаты в целом коррелируют с информацией других исследователей и отражают частный случай применения взятых конкретных клеточных линий в исследовании. При выборе оборудования для культивирования клеток в роллерных бутылях следует учитывать минимальную частоту вращения роллеров на роллерной установке при работе с клеточной линией НЕК293 и линиями со сходными особенностями прикрепления к ростовой поверхности.

Изучение адгезии клеток к ростовой поверхности для других клеточных линий позволит повысить эффективность получения биомассы клеток как субстрата накопления и впоследствии вируссодержащих материалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведения экспериментальных исследований оптимизирован начальный этап роллерного культивирования двух клеточных линий — НЕК293 и Vero. Определено, что оптимальной частотой вращения для клеточной линии Vero является 0,4–0,5 об/мин на протяжении всего периода культивирования, а для НЕК293 в первые сутки необходима частота вращения 0,2 об/мин с последующим увеличением до 0,5 об/мин для формирования качественного монослоя.

Различия в выборе частоты вращения обусловлены тканевой принадлежностью линий клеток. Клеточная линия Vero проявляет более высокую степень адгезии к ростовой поверхности и устойчивость к механическим внешним воздействиям, в отличие от клеточной линии НЕК293.

Полученные данные практически значимы для масштабирования процессов наработки клеточной/вирусной биомассы при монослойном культивировании и могут представлять интерес для специалистов, проводящих работы по разработке экспериментальных вирусных препаратов с использованием адгерентных линий клеток.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: И.И. Тузова — выполнение экспериментальной части исследования, создание черновика рукописи, ее редактирование; Т.И. Чиркина — анализ и интерпретация полученных данных; И.А. Чуркин — концептуализация и руководство исследованием; А.Н. Лях — подбор материалов и методов для выполнения исследования; К.М. Мефёд — выбор направления экспериментальной работы и утверждение итоговой версии статьи; В.А. Максимов — администрирование проекта.