Разработка критериев для сортировки облученных лиц на основе анализа дицентрических хромосом: пилотное исследование

ВВЕДЕНИЕ

В условиях крупномасштабной радиационной аварии, затрагивающей большое количество людей, использование физических методов восстановления дозы часто затруднено или невозможно. При авариях с участием населения отсутствие информации о дозах осложняет корректную оценку рисков реализации медико-биологических эффектов облучения и принятие медицинских решений [1][2].

Важно оперативно выявлять людей с высокой вероятностью развития острой лучевой болезни (ОЛБ) средней и тяжелой степени, так как им требуется лечение в специализированных учреждениях. Курабельной формой ОЛБ является костномозговая форма при дозах облучения 1–10 Гр, в рамках которой в зависимости от дозы выделяют различные степени тяжести заболевания. По данным литературы, клинически распознаваемые признаки костномозгового синдрома ОЛБ отмечаются после облучения в дозах выше 1 Гр, в диапазоне облучения в дозах 1–2 Гр наблюдается легкая степень ОЛБ, средняя степень тяжести ОЛБ наблюдается в диапазоне доз 2–4 Гр [3][4].

Медицинская оценка обычно включает сбор анамнеза (в том числе местонахождение во время инцидента), физикальное обследование, учет клинических симптомов и, по возможности, определение абсолютного числа лимфоцитов и/или нейтрофилов. Гематологические исследования помогают распределить подвергшихся облучению лиц на критические группы, но дают неоднозначные результаты при комбинированных травмах или сопутствующих заболеваниях [3][5–7].

Оценка дозы облучения критична при планировании медицинской помощи. Когда физическая дозиметрия невозможна, применяется цитогенетическая биодозиметрия на основе учета нестабильных хромосомных аберраций в метафазах Т‑лимфоцитов периферической крови [6][8]. Наличие в спектре наблюдаемых аберраций повышенных частот дицентрических хромосом и центрических колец свидетельствует о воздействии радиационной природы. Анализ этих типов аберраций хромосом называют «золотым стандартом» для целей биологической дозиметрии, что обусловлено зависимостью «доза – эффект» и низкой спонтанной частотой этих типов аберраций [9]. Цитогенетический метод требует специализированной лаборатории, в которой проводят культивирование клеток около двух суток, приготовление и окрашивание препаратов, микроскопический анализ с оцифровкой изображений, а также расчет дозы с использованием калибровочных кривых [10–13]. Вручную за рабочий день один исследователь может проанализировать не более ~500 клеток, что делает метод трудо- и ресурсоемким.

При массовых инцидентах в целях быстрой медицинской сортировки не требуется точная оценка поглощенных доз облучения, а нужны подходы, существенно сокращающие ресурсоемкость и увеличивающие пропускную способность лабораторий.

Предположительно разрабатываемый в данной работе подход позволит оперативно провести цитогенетическое обследование облученных лиц, подвергшихся относительно равномерному гамма-облучению всего тела, с целью сформировать группы риска по реализации костномозгового синдрома ОЛБ.

Рабочей гипотезой является предположение о возможности разделения образцов крови, подвергшихся in vitro гамма-облучению, на дозовые диапазоны, соответствующие развитию легкой и средней степени тяжести ОЛБ, посредством выявления нестабильных хромосомных аберраций при анализе относительно небольшого числа метафаз Т‑лимфоцитов периферической крови. Предполагается, что с увеличением дозы гамма-облучения возрастает вероятность обнаружения дицентрических хромосом уже в первых по счету анализируемых метафазах Т‑лимфоцитов.

Предлагаемый подход основывается на автоматизированной оцифровке препаратов и анализе данных с применением специализированного программного обеспечения, что обеспечивает более высокое качество получаемого первичного материала, воспроизводимость результатов и позволяет исследователям верифицировать найденные хромосомные аберрации.

Цель работы заключается в разработке эффективных цитогенетических критериев для выявления людей с повышенным риском развития костномозговой формы ОЛБ при массовых радиационных инцидентах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании приняли участие 12 доноров:

• 7 доноров в возрасте 57–73 лет (средний возраст — 60 ± 2 года), 5 женщин и 2 мужчин;
• 5 доноров в возрасте 23–38 лет (средний возраст 27 ± 3 года), 4 женщины и 1 мужчина.

На момент взятия образца крови у доноров в анамнезе не было данных о лечении заболеваний с применением источников ионизирующих излучений, также отсутствовали тяжелые формы сахарного диабета, аутоиммунные заболевания, не было гемотрансфузии, а также рентгенологических обследований в течение 3 мес., предшествующих исследованию.

Для определения лиц, соответствующих вышеперечисленным критериям, проведена предварительная беседа с потенциальными участниками. При отсутствии критериев исключения проводили анкетирование и взятие согласия на обработку персональных данных и участие в исследовании.

Получение метафазных хромосом из Т‑лимфоцитов периферической крови человека

Забор венозной крови объемом 6 мл производили из локтевой вены в стерильные пробирки с гепарином. На каждого человека готовили по 3 образца: два из них подвергали облучению in vitro на установке ИГУР-1М (ЗАО «Квант», Россия) в дозах 1 и 2 Гр, а третий образец облучению не подвергался. ИГУР-1М обладает следующими характеристиками: источник ¹³⁷Cs, мощность дозы 0,014 Гр/с, неравномерность облучения 5%.

Цитогенетические препараты из Т‑лимфоцитов периферической крови получали согласно протоколу, который включал четыре последовательных этапа: культивирование клеток до стадии метафазы, гипотоническую обработку, фиксацию метафазных пластинок и приготовление препаратов хромосом, как описано в работе [14].

Культивирование Т‑клеток проводили в стерильных бакпечатках («Медполимер», Россия). Культура включала: 2 мл крови, 5 мл среды RPMI-1640 («Панэко», Россия), 0,5 мл отборной эмбриональной телячьей сыворотки («Панэко», Россия), фитогемагглютинин (ФГА) в итоговой концентрации 20 мг/мл («Панэко», Россия). Клетки культивировали в СО₂ инкубаторе при 37,5 °С в течение 54 ч. За 2 ч до окончания культивирования в культуру вводили раствор колхицина («Панэко», Россия) в итоговой концентрации 0,03 мг/мл.

Для дальнейшей обработки клеточную суспензию переносили в центрифужные пробирки, центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин на центрифуге (ThermoScientific, США). Супернатант убирали, оставляя осадок. Для гипотонической обработки клеток приливали теплый 0,55% раствор КСl (37 °С), ресуспендировали осадок и оставляли на 30 мин в термостате при 37 °С. Затем смесь центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин. Осторожно удаляли супернатант, ресуспендировали осадок и приливали холодный (4 °С) свежеприготовленный фиксатор (3 части спирта этилового и 1 часть ледяной уксусной кислоты), доводя общий объем содержимого пробирки до 10 мл. Клетки оставляли в фиксаторе на 10 мин при 4 °С, затем центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, затем приливали свежую порцию фиксатора. Таким образом, клетки проводили через фиксатор три раза.

Для получения препаратов хромосом общий объем осадка в пробирке доводили свежим фиксатором до 1,5 мл, хорошо перемешивали пипеткой и раскапывали клеточную суспензию на охлажденное стекло (2 капли). Стекло сушили на термоплато при 40 °С. Качество препарата проверяли при фазово-контрастной микроскопии. Готовили 3 стекла на 1 донора. Окрашивали препараты 2% красителем Гимза («Панэко», Россия) в течение 5–6 мин.

Анализ хромосомных препаратов проводили при световой микроскопии. Для этого с помощью системы поиска и оцифровки изображений Metafer (Metasystems, Германия) получали изображения качественных метафаз с использованием иммерсионного объектива ×63. Работа с изображениями выполнялась с помощью программного обеспечения Ikaros (Metasystems, Германия).

Для цитогенетического анализа выбирали метафазные пластинки, содержащие 45–47 хромосом, с хорошим разбросом, без наложений. В ходе исследования заполняли цитогенетический протокол, в котором отражали хромосомные аберрации: дицентрические, кольцевые хромосомы, парные фрагменты, а также ацентрические кольца. На один препарат просчитывали 500–1000 клеток в образцах без облучения и 220–500 клеток в образцах с облучением. На рисунке представлены фотографии метафаз Т‑лимфоцитов с хромосомными аберрациями.

Найденные хромосомные аберрации были сгруппированы следующим образом: дицентрические хромосомы; нестабильные хромосомные обмены (дицентрические и кольцевые хромосомы); парные фрагменты; ацентрические кольца.

В работе проводился подсчет метафаз Т‑лимфо­цитов с дицентрическими хромосомами по порядку их встречаемости среди всех метафаз, включенных в анализ на оцифрованном препарате.

Методы статистической обработки данных

Частота встречаемости хромосомных аберраций рассчитывалась на одну клетку. Были использованы стандартные методы описательной статистики: рассчитаны средние значения и стандартная ошибка среднего для хромосомных аберраций.

При расчете количества метафаз Т‑лимфоцитов, в которых были выявлены дицентрические хромосомы по порядку их встречаемости при анализе препарата, данные представлены в виде медианы (M_e) и 95% доверительного интервала (ДИ). ДИ оценки медианы вычисляли процедурой бутстрепа, число итераций 1000. Также оценивали 10 и 90 процентили (%), минимальные и максимальные индивидуальные значения количества Т‑лимфоцитов с дицентрическими хромосомами по порядку их встречаемости при анализе препарата.

Ожидаемое количество клеток, в которых возможно идентифицировать дицентрические хромосомы (D_n), рассчитывали по формуле (1):

(1)

где X — ожидаемое количество клеток, в которых возможно идентифицировать дицентрические хромосомы по порядку встречаемости в препарате; D_n — порядковый номер дицентрических хромосом при анализе препарата (D_n = 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30); F — частота встречаемости дицентрических хромосом, рассчитанная на одну клетку.

Для расчета вероятности встречаемости дицентрических хромосом в образцах без облучения для каждого донора методом скользящей средней проанализировали среднее количество дицентрических хромосом при величине «окна», равного 10, 20, 30, 50, 100 клеткам. Затем на основании этих значений рассчитали вероятность частоты встречаемости дицентрических хромосом по формуле (2):

(2)

где P — вероятность встречаемости дицентрических хромосом; m — количество идентифицированных дицентрических хромосом; k — количество проанализированных клеток (величина окна).

Для статистического анализа использовали статистическую программу Past 4.01 и SPSS Statistics 21.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования в образцах без облучения дицентрические хромосомы были выявлены у 33% обследуемых лиц (4 человека из 12). Частота встречаемости дицентрических хромосом варьировала от 0 до 1 абс. ч. на 500 клеток и от 0 до 2 абс. ч. на 1000 клеток. Средняя частота встречаемости дицентрических хромосом и нестабильных хромосомных обменов составила 0,0007 ± 0,0003 на одну клетку, парных фрагментов — 0,016 ± 0,003 на одну клетку, ацентрических колец — 0,0003 ± 0,0002 на одну клетку.

После in vitro облучения образцов крови в дозе 1 Гр средняя частота встречаемости хромосомных аберраций статистически значимо возросла по сравнению с необлученными образцами (p < 0,0001). При этом средняя частота встречаемости дицентрических хромосом составила 0,073 ± 0,008 на одну клетку, нестабильных хромосомных обменов — 0,081 ± 0,009 на одну клетку, парных фрагментов — 0,17 ± 0,01 на одну клетку, ацентрических колец — 0,009 ± 0,002 на одну клетку.

При in vitro облучении в дозе 2 Гр средняя частота встречаемости дицентрических хромосом составила 0,28 ± 0,02 на одну клетку, нестабильных хромосомных обменов — 0,30 ± 0,02 на одну клетку, парных фрагментов — 0,64 ± 0,03 на одну клетку, ацентрических колец — 0,030 ± 0,005 на одну клетку (табл. 1).

В образцах без облучения (среди тех лиц, у которых были выявлены дицентрические хромосомы) ожидаемое количество Т‑лимфоцитов с одной дицентрической хромосомой составило от 412 до 500 клеток. При этом первая дицентрическая хромосома была определена в Т‑лимфоцитах с порядковыми номерами 77, 169, 341 и 314. Вторая дицентрическая хромосома идентифицирована у двух доноров в Т‑лимфоцитах с порядковым номером 341 (в одной клетке было 2 дицентрические хромосомы) и в 492 клетке.

В таблице 2 представлено ожидаемое количество клеток, в которых возможно идентифицировать дицентрические хромосомы по порядку подсчета клеток при in vitro облучении в дозах 1 и 2 Гр. Согласно представленным данным после облучения в дозе 1 Гр две дицентрические хромосомы обнаруживали в Т‑лимфоцитах с 17 по 69 клетку, M_e = 27 [ 95% ДИ: 21; 41]. Для выявления 5 дицентрических хромосом необходимо проанализировать 67 Т‑лимфоцитов [ 95% ДИ: 41; 83], для выявления 10 дицентрических хромосом — 135 Т‑лимфоцитов [ 95% ДИ: 103; 206], для 20 дицентрических хромосом — 270 Т‑лимфоцитов [ 95% ДИ: 206; 414], для идентификации 30 дицентрических хромосом — 405 Т‑лимфоцитов [ 95% ДИ: 309; 620].

При дозе in vitro облучения 2 Гр ожидаемое количество Т‑лимфоцитов, которые следует проанализировать до обнаружения аналогичного количества дицентрических хромосом, статистически было значимо ниже, чем при дозе in vitro облучения 1 Гр (p < 0,001): 2 дицентрические хромосомы были выявлены с 5 по 12 клетку; медианное значение Т‑лимфоцитов составило 8 [ 95% ДИ: 6; 9]; 5 дицентрических хромосом выявлено при анализе 19 Т‑лимфоцитов [ 95% ДИ: 16; 22]; 10 дицентрических хромосом — при анализе 38 Т‑лимфоцитов [ 95% ДИ: 31; 45]; 20 дицентрических хромосом — при анализе 77 Т‑лимфоцитов [ 95% ДИ: 63; 90]; 30 дицентрических хромосом — при анализе 115 Т‑лимфоцитов [ 95% ДИ: 94; 134].

В таблице 3 представлены данные о количестве метафаз Т‑лимфоцитов с выявленными дицентрическими хромосомами по порядку их анализа на оцифрованном цитогенетическом препарате. При in vitro облучении в дозе 1 Гр медианное количество клеток, в которых были выявлены дицентрические хромосомы, статистически значимо отличалось от ожидаемых значений только для 1, 25 и 30 дицентрической хромосомы по порядку их идентификации при анализе. Так, ожидаемое медианное значение Т‑лимфоцитов статистически значимо было выше полученного экспериментально: p = 0,002, 0,032 и 0,019 соответственно.

При in vitro облучении в дозе 2 Гр медиана ожидаемого количества Т‑лимфоцитов с одной дицентрической хромосомой была статистически значимо выше, чем при непосредственном анализе препарата (4 против 2, р = 0,033). В остальных случаях статистически значимых различий не выявлено.

Результаты анализа показали, что для идентификации первых дицентрических хромосом при in vitro гамма-облучении Т‑лимфоцитов в дозах 1 и 2 Гр достаточно проанализировать относительно небольшое количество клеток. По нашим и литературным данным, в образцах без облучения частота встречаемости дицентрических хромосом составляла от 0 до 2 на 1000 проанализированных клеток [15].

В таблице 4 показана вероятность выявления первой дицентрической хромосомы в образцах без облучения: при анализе 50 клеток она составила 4,9%, при анализе 100 клеток — 9,4%. Вероятность выявления в 100 метафазах Т‑лимфоцитов двух дицентрических хромосом составила 2%.

Таким образом, поскольку существует вероятность обнаружить две дицентрические хромосомы при анализе первых 100 метафаз Т‑лимфоцитов в образцах без облучения, необходимо увеличить количество идентифицированных дицентрических хромосом для индикации радиационного воздействия. На основании данных, представленных в таблице 3, для идентификации радиационного воздействия и отнесения образца к дозовому диапазону предлагается оценивать количество метафаз Т‑лимфоцитов с пятой дицентрической хромосомой по порядку анализа цитогенетического препарата. Так, медианное значение метафаз Т‑лимфоцитов с пятой дицентрической хромосомой составило 56 [ 95% ДИ: 27; 85] при in vitro гамма-облучении в дозе 1 Гр и 16 [ 95% ДИ: 12; 25] при in vitro гамма-облучении в дозе 2 Гр (p < 0,001). Выбор медианы и соответствующего ей доверительного интервала в качестве критерия разделения облученных лиц на дозовые диапазоны основан на ее устойчивости к влиянию выбросов, характерных для распределений, содержащих межиндивидуальные различия радиочувствительности. Несмотря на очевидную связь точности оценки медианы с объемом выборки, расширение последней лишь частично уменьшит неопределенность оценки центрального положения. Мы полагаем, что уменьшение доверительного интервала будет незначительным ввиду индивидуальных реакций на излучение. Следовательно, использование медианных значений и доверительного интервала представляется оптимальным решением на данном этапе исследования.

Для принятия решения об отнесении потенциально облученного образца к одному из дозовых диапазонов необходимо проанализировать то количество клеток, в которых будет идентифицировано пять дицентрических хромосом. На основании предварительных результатов предлагается следующий алгоритм анализа метафаз Т‑лимфоцитов.

1. Определение порядкового номера проанализированной метафазы Т‑лимфоцита, содержащей пятую по порядку анализа дицентрическую хромосому.
2. Если пятая по порядку анализа дицентрическая хромосома выявлена в первых 26 клетках, то облученный образец следует отнести к дозовому диапазону радиационного воздействия от 2 Гр или выше.
3. Если пятая дицентрическая хромосома при анализе выявлена с 27 по 85 метафазу Т‑лимфоцита, облученный образец следует отнести к радиационному воздействию в дозовом диапазоне от 1 Гр или выше.
4. Если при анализе 85 метафаз Т‑лимфоцитов идентифицировано менее 5 дицентрических хромосом, облученный образец необходимо отнести к диапазону воздействия менее 1 Гр.
5. Если при анализе 50 метафаз Т‑лимфоцитов не было обнаружено ни одной дицентрической хромосомы, то с вероятностью 94% поглощенная доза гамма-­излучения исследуемого образца близка к нулю.

В таблице 5 представлена доля обследованных лиц, у которых порядковый номер Т‑лимфоцита, содержащего пятую дицентрическую хромосому, находится в диапазоне, рассчитанном в соответствии с вышеизложенным алгоритмом.

Все необлученные образцы были отнесены в группу «ниже 1 Гр»; 100% из них определили в группу, где доза облучения близка к нулю. В то же время, согласно алгоритму, 2 (16,7%) образца, облученных в дозе 1 Гр, были отнесены в группу «ниже 1 Гр», а 2 (16,7%) образца, облученных в дозе 2 Гр, были отнесены в группу «1 Гр или выше».

Предварительные результаты нашего исследования выявили потенциальную проблему ложноотрицательной идентификации, связанную с возможным занижением расчетного дозового диапазона для определенной доли облученных образцов, в то время как для медицинской сортировки предпочтителен консервативный подход, когда облученный будет отнесен к дозовой группе с более высокими значениями воздействия. Консервативный подход снижает риск недооценки воздействия ионизирующего излучения и гарантирует получение необходимой медицинской помощи всем потенциально облученным лицам. На следующем этапе исследования необходимо уточнить критерии отнесения облученного образца к той или иной дозовой группе с учетом требований консервативности.

По данным литературы, нижний предел чувствительности метода оценки нестабильных хромосомных обменов зависит от количества проанализированных клеток и в среднем составляет 100–250 мГр для редкоионизирующих излучений. При высоких дозах излучения (5–6 Гр и более) происходит существенное нарушение клеточной пролиферации, поэтому меньшее количество клеток достигает метафазы и попадает в цитогенетический анализ [16–18]. Медицинскую сортировку облученных людей на основе частоты встречаемости дицентрических хромосом или нестабильных хромосомных обменов в Т‑лимфоцитах рекомендуется проводить при уменьшении количества анализируемых метафаз Т‑лимфоцитов до 50 на человека, что заметно увеличит пропускную способность лаборатории. При анализе 20–50 клеток увеличиваются доверительные интервалы оценки доз излучения, оцененных с использованием калибровочной кривой. При этом дозовый интервал 0–0,75 Гр и интервал 2–3 Гр однозначно отличимы при анализе 50 клеток [19][20], что согласуется с результатами, полученными в исследовании.

Важно отметить, что в рамках настоящего исследования не стояла задача точного определения доз аварийного облучения на основе зависимости «доза – эффект». В условиях ограниченного количества техники и человеческих ресурсов необходимо разработать критерии, которые помогут за счет уменьшения числа анализируемых клеток оперативно разделить экспонированный контингент на группы риска развития костномозговой формы ОЛБ. Это позволит планировать и корректировать дальнейшее медицинское наблюдение. После цитогенетической сортировки возможно увеличение количества анализируемых клеток для целей биодозиметрии.

В дальнейшем планируется валидировать разработанный метод на других выборках, провести межлабораторные сравнения и на основе полученных данных оптимизировать алгоритм оценки дозовых интервалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из задач при оказании экстренной медицинской помощи облученным людям при массовых радиационных инцидентах является проведение медицинской сортировки, направленной на выявление лиц с высоким риском развития ОЛБ. Был разработан предварительный алгоритм цитогенетической сортировки, основанный на определении количества анализируемых метафаз Т‑лимфоцитов, содержащих пятую дицентрическую хромосому по порядку их анализа. Установлено, что при идентификации пятой дицентрической хромосомы в первых 26 анализируемых метафазах Т‑лимфоцитов доза облучения находилась в диапазоне от 2 Гр или выше. Если пятая дицентрическая хромосома была выявлена с 27 по 85 про­анализированную метафазу Т‑лимфоцитов, доза облучения находилась в диапазоне 1 Гр или выше. В случае анализа 85 метафаз Т‑лимфоцитов, при котором идентифицировано менее 5 дицентрических хромосом, доза облучения находилась в диапазоне менее 1 Гр. Если при анализе 50 метафаз Т‑лимфоцитов не было обнаружено ни одной дицентрической хромосомы, доза облучения находилась в диапазоне менее 1 Гр и/или была близка к нулевым значениям. Данный алгоритм является предварительным и требует доработки с учетом консервативного подхода для снижения риска недооценки воздействия ионизирующего излучения. Планируется продолжение исследований с доработкой алгоритма и валидацией полученных результатов.

Вклад авторов. Ю.Р. Ахмадуллина — планирование исследования, статистическая обработка результатов, интерпретация результатов, написание, редактирование и подготовка итоговой версии статьи; Я.В. Кривощапова — проведение лабораторных исследований, получение первичных данных, статистическая обработка первичных данных, написание текста статьи; А.В. Куприянова — проведение лабораторных исследований, получение первичных данных, редактирование статьи.