Биоинженерный скаффолд на основе гидрогеля для регенерации мышц

ВВЕДЕНИЕ

Разработка инновационных тканеинженерных конструкций является одним из приоритетных направлений современной регенеративной медицины. Регенерация скелетных мышц — это комплексный процесс, который зависит от миграции различных типов клеток в раневое ложе, сигнальных молекул, механических сигналов межклеточного матрикса и его физико-химических свойств. В последние десятилетия были разработаны различные стратегии тканевой инженерии скелетных мышц, однако по-прежнему наблюдается высокий спрос на создание новых высокоэффективных методов и материалов, способствующих восстановлению структуры скелетных мышц и функциональной регенерации, которые могли бы быть использованы при терапии мышечных дефектов в клинической практике [1].

Регенерация мышц зависит от наличия гетерогенной популяции резидентных мышечных стволовых клеток (также называемых сателлитными клетками), наличия интерстициальных клеток и образования кровеносных сосудов de novo и в основном контролируется белками межклеточного матрикса и факторами, ассоциированными с ними (TGF-β, IL-4) [2]. Наиболее часто применяемым клиническим подходом для заживления дефектов мышечной ткани является трансплантация аллогенных мышечных клеток. Однако данная терапия имеет существенные ограничения из-за риска развития реакций отторжения, наличия у донора различных патологий и недостаточного количества донорских клеток [3]. Кроме того, доставка и удержание клеток в мышцах неэффективны, что препятствует устойчивой регенерации, необходимой для достаточного функционального восстановления [4][5]. Поэтому требуется внедрение альтернативных стратегий. Скаффолды на основе биоматериалов являются мощным инструментом для восстановления клеточного микроокружения и обеспечения регенерации скелетной мышцы, сила сокращения которой в полной мере соответствует здоровой ткани [5–8].

Для индукции регенерации скелетных мышц необходима имитация нативного микроокружения для клеток не только за счет воссоздания межклеточного матрикса путем подбора биоматериалов и способа получения трехмерного скаффолда, но и посредством включения в состав конструкции биологически активных соединений. Современные разрабатываемые скаффолды по микро- и наноструктуре и физико-химическим свойствам представляют собой искусственный межклеточный матрикс для клеток, воспроизводя свойства нативной ткани. Кроме того, биологически активные агенты, такие как белки и факторы роста, включенные в состав скаффолда, необходимы для поддержания адгезии и пролиферации клеток, а также для стимуляции синтеза собственного межклеточного матрикса. С целью достижения оптимальных для регенерации скелетных мышц механических, структурных, физико-химических и биологических свойств скаффолда был разработан ряд многофункциональных биоматериалов, способных выполнять несколько важных функций, таких как воздействие на миграцию и пролиферацию клеток [9], доставка лекарственных препаратов [10] и регуляция дифференцировки стволовых клеток [11].

Одним из наиболее перспективных типов конструкций для регенерации скелетных мышц являются скаффолды, полученные на основе гидрогелей. Гидрогели представляют собой трехмерные сшитые гидрофильные полимерные матрицы с высоким содержанием воды, которые имитируют нативную водную среду организма [7][12]. Гидрогели имеют сходство с естественным межклеточным матриксом по структуре; кроме того, полученные на их основе конструкции могут быть разной формы [4].

Биосовместимые материалы, используемые для получения скаффолдов на основе гидрогелей, должны обладать следующими характеристиками: скорость деградации и механические свойства, соответствующие нативной ткани мышцы; отсутствие токсического эффекта и низкий риск развития воспаления; способность поддерживать миграцию, адгезию и пролиферацию клеток [13][14].

Для регенерации скелетных мышц применяется широкий спектр материалов, как природных, так и синтетических. Синтетические полимеры, такие как поли-L-молочная кислота (PLA) [15][16], поли(L-лактид-со-гликолид) (PLGA) [16], поликапролактон [17–20], полиэтиленгликоль (ПЭГ) [21–23] и их сополимеры [24] и различные полиуретаны [25–28], являются наиболее часто используемыми материалами для тканевой инженерии мышечной ткани. Преимуществами синтетических полимеров являются простота в обработке и структурировании, возможность контроля механических свойств и скорости высвобождения биологически активных соединений. Однако зачастую такие материалы обладают низким уровнем биосовместимости и образуют токсичные продукты резорбции либо являются небиодеградируемыми [6][29]. Современные стратегии разработки высокоэффективных конструкций для заживления мышечных дефектов базируются на создании скаффолдов на основе природных материалов по причине сочетания их биосовместимости и биодеградируемости с образованием нетоксичных соединений [7]. Наиболее часто в роли таких материалов выступают компоненты межклеточного матрикса, такие как коллаген [30][31], фибрин [32][33], гиалуроновая кислота [34] и др. Также широко применяются полимеры природного происхождения: альгинат [35–37], фиброин шелка, желатин [12][30][38].

Несмотря на преимущества природных полимеров, создание конструкций на их основе сопряжено со множеством проблем, таких как недостаточная механическая прочность и эластичность, низкая растворимость, отсутствие стабильности в физиологических условиях и сложность в структурировании материалов. На сегодняшний день эффективные клинические подходы для восполнения обширных дефектов скелетных мышц по-прежнему включают только трансплантацию мышечных аутографтов, при этом в настоящее время проходит клинические испытания один материал, который представляет собой децеллюляризованную кожу свиньи (XenMatrix™ AB Surgical Graft, BD, США). Поэтому поиск новых материалов и разработка подходов к созданию эффективных конструкций для регенерации дефектов скелетных мышц остаются актуальными задачами тканевой инженерии.

Цель работы — разработка медицинского изделия (биоинженерного скаффолда) на основе полимерного гидрогеля для заживления обширных дефектов скелетных мышц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение биоинженерного скаффолда

Внутренний слой скаффолда представляет собой смесь 2% коллагена (Лужский завод «Белкозин», Россия), 1% гиалуроната натрия, приготовленного на 0,9% NaCl, («Платина», Россия) и раствора 10% альбумина («Ивановская областная станция переливания крови», Россия) в объемном соотношении 70:20:10 соответственно. Средний слой состоит из 2% коллагена, 1% гиалуроната натрия и 10% раствора альбумина в объемном соотношении 30:35:35. Внешний слой скаффолда состоит из 2% раствора коллагена, 1% раствора гиалуроновой кислоты и 10% раствора альбумина в объемном соотношении 10:80:10 соответственно. В качестве сшивающего агента был использован раствор, состоящий из 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) (Macklin LLC, Китай) и N-гидроксисукцинимида (NHS) (Sigma-Aldrich, США) в соотношении 4:1. Для формирования скаффолда смесь биополимерных гидрогелей вспенивали и заливали в отпечатанные с помощью 3D-прототипирования формы, далее образцы поэтапно замораживали и высушивали в лиофильной сушке (Labconco, США).

Стерилизация

В качестве метода стерилизации была выбрана газовая низкотемпературная стерилизация этиленоксидом в соответствии с ГОСТ ISO 11135-2017¹.

Каждый образец скаффолда индивидуально заключали в двойную газопроницаемую упаковку — пленку Tyvek (DuPont de Nemours, Inc., Делавер, США). Стерилизация осуществлялась с помощью газового стерилизатора/аэратора Steri-Vac 8XL (224 л) (3M Health Care, Сент-Пол, США). Программа стерилизации № 1 по ГОСТ ISO 11135-2017: температура стерилизации — 37 °С, стерилизационная выдержка — 180 мин, концентрация этиленоксида – 100%. С целью выявления точной концентрации в камере стерилизатора осуществляли взвешивание баллона до и после стерилизации. По результатам проведенных расчетов концентрация этиленоксида непосредственно в камере должна составлять не менее 730,0 ± 30,0 мл/л. Аэрация образцов после стерилизации этиленоксидом стерильным воздухом проводилась 12 ч.

Сканирующая электронная микроскопия

Микроструктуру и морфологию поверхности и срезов образцов изучали с помощью микроскопа Tescan VEGA III (сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), Брно, Чехия), оснащенного системой энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС; INCA Energy Oxford Instruments, Абингдон, Великобритания) для анализа химического состава. Образцы предварительно покрывали золотом по технологии Q150R Quorum Technologies (Льюс, Великобритания). Изображения поверхности материалов были получены при давлении 7,3 × 10⁻² Па в колонке и 1,5 × 10⁻¹ Па в камере.

Анализ механических свойств полученного скаффолда

Для определения прочностных характеристик на разрыв из полученных скаффолдов вырезали образцы гантелеобразной формы с размерами, указанными на рисунке 1. Образцы подготавливали в одно время и в одинаковых условиях. При подготовке образцов следили за тем, чтобы вся поверхность была ровной, без видимых дефектов. Подготовленные образцы помещали в физиологический раствор (0,9% раствор NaCl) при температуре 37 ± 2 °C на полчаса, после чего помещали их в зажимы испытательной машины. При закреплении следили, чтобы зажимы не скользили по образцу, не разрушали образец в месте крепления.

Прочность на разрыв и эластичность полученных материалов исследовали на испытательной машине Instron ElectroPuls E3000 (Instron, США) при скорости нагружения 5,0 мм/мин с использованием 5 образцов для каждой серии. Эксперименты проведены в физиологическом растворе (0,9% водный раствор NaCl) при температуре 37 ± 2 °C. Перед началом испытаний образцы выдерживали полчаса в физиологическом растворе при температуре 37 ± 2 °C, после чего закрепляли в держателях. В ходе эксперимента образец растягивали вдоль его главной продольной оси, измеряя выдерживаемую нагрузку с погрешностью не более 1% от измеряемой величины.

Прочность при разрыве вычисляли по формуле (1):

(1)

где F — растягивающая нагрузка, при которой образец разрушился (Н); S — поперечное сечение образца (мм²); σ — прочность при разрыве (кПа).

Испытания по исследованию эластичности схожи с испытаниями на разрыв. Из образцов скаффолда также вырезали образцы гантелеобразной формы с размерами, указанными на рисунке 1. Образцы подготавливали в одно и то же время при одинаковых условиях после визуальной оценки их на целостность.

Относительное удлинение при разрыве вычисляли по формуле (2):

(2)

где l₂ — изначальная длина узкой части образца (мм); l₂* — длина узкой части образца в момент разрыва (мм); ε — относительное удлинение при разрыве (%).

Для определения модуля объемного сжатия как отношения приращения напряжения к соответствующему приращению относительной деформации сжатия из полученных скаффолдов вырезали образцы прямоугольной формы размерами 80 ± 2 на 10 ± 2 мм, толщина образцов составляла 4 ± 0,5 мм. Образцы подготавливали в одно время и в одинаковых условиях. При подготовке образцов следили за тем, чтобы вся поверхность была ровной, без видимых дефектов.

Оценка цитотоксического действия разработанных материалов в отношении клеток CCL 1 (NCTC клон 929) и CCL 163 (Balb/3Т3 клон А31) с помощью флуоресцентной микроскопии

Исследование цитотоксичности полученного скаффолда было проведено согласно ГОСТ ISO 10993-5-2011². Метод основан на определении соотношения живых и погибших клеток, культивируемых на материале, путем окрашивания клеток диацетатом флуоресцеина (окрашивает цитоплазму живых клеток в зеленый цвет) и йодидом пропидия (окрашивает ядра погибших клеток в красный цвет), методом флуоресцентной или сканирующей конфокальной микроскопии.

Клетки культивировали в смеси питательных сред DMEM/F12 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HiMedia Laboratories, Индия), 40 мкг/мл сульфата гентамицина (Sigma-Aldrich, США) при 37 °С в условиях 5% содержания СО₂ в газовой смеси. Для анализа клетки высевали в лунки 96-луночного планшета (SPL Life Sciences, Южная Корея), содержащие образцы разработанных материалов, в концентрации 5 × 10⁴ клеток/мл. После 24 и 96 ч инкубации на разработанном материале клетки окрашивали в среде L-15 (Sigma-Aldrich, США) с 1% эмбриональной бычьей сывороткой (HiMedia Laboratories, Индия), содержащей 1 мкг/мл диацетата флуоресцеина (Sigma-Aldrich, США) и 2 мкг/мл йодида пропидия (Sigma-Aldrich, США), в течение 25 мин при 37 °С. По истечении времени инкубации клетки промывали два раза средой L-15 с добавлением 1% эмбриональной бычьей сыворотки. Анализ живых и погибших клеток осуществляли c использованием микроскопической станции Nikon Eclipse Ti-E (Nikon, Япония) и сканирующего конфокального микроскопа TCS SP5 (Leica, Германия). Для анализа оценивали более 500 клеток.

Количество живых клеток после инкубации на разработанном материале рассчитывали в процентах относительно контроля по формуле (3):

(3)

где ЧЖК_Э — число живых клеток после инкубации на разработанном материале; ЧЖК_К — число живых клеток в контрольных условиях (не инкубировавшихся на разработанном материале).

Статистическая обработка данных

Статистический анализ проводили с использованием языков программирования Python 3 (версия 3.9.16) и R (версия 4.3.0) в средах разработки Spyder (версия 5.4.1) и RStudio (версия 2023.03.0+386) соответственно, с применением пакетов Pandas (версия 1.5.3), Numpy (версия 1.23.5), Scipy (версия 1.10.0) и PMCMRplus (версия 1.9.10). Результаты представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения (M ± SD). Опыты проводили не менее чем в трех повторах (n ≥ 3). Статистическую значимость отличий определяли с помощью одностороннего дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным сравнением Холма – Сидака, критический уровень значимости α приняли равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования был получен пористый биоинженерный скаффолд, который представляет собой слоистую конструкцию на основе комбинации натуральных полимеров, коллагена и гиалуроната натрия с добавлением EDC и NHS для формирования слоев с различными сроками резорбции и протеолитической деградации [40]. Добавление сшивающих агентов в том числе необходимо ввиду того, что коллагеновые скаффолды обладают низкими показателями механической прочности и структурной стабильности при гидратации, что ограничивает их применение в определенных тканях.

Пористая структура образцов скаффолда была получена с помощью комбинации методов послойной заливки / формования вспененных полимеров и последующей пошаговой заморозки.

В ходе анализа микроструктуры с использованием СЭМ было выявлено, что полимерные скаффолды обладают многослойной пористой губчатой структурой. Выявлено (рис. 2), что средний слой толщиной 1,2 ± 0,1 мм имел крупную равномерную взаимосвязанную пористость, форма пор была близка к сферической, размер 100–150 мкм, толщина стенок полимерного каркаса менее 5 мкм. Верхний слой толщиной 300–500 мкм имел более плотную слоистую структуру, толщина стенок полимерного каркаса менее 2 мкм, форма пор щелевидная, размером до 200 мкм в длину и 50 мкм в ширину. В сравнении с центральным слоем наблюдали значительно меньше взаимосвязанности пор, также практически отсутствовала канальная структура, а поры в основном были изолированы друг от друга стенками полимера. Такая архитектура конструкции была достигнута за счет криоструктурирования путем пошаговой заморозки образца, что согласуется с литературными данными [41].

Для последующих экспериментов был подобран протокол стерилизации разработанной конструкции с помощью этиленоксида. Данный метод является наиболее подходящим способом для полимерных имплантируемых изделий [42].

Были проведены исследования по оценке механических свойств полученного скаффолда: прочность на разрыв составила 50 ± 0,5 кПа, относительное удлинение — 26 ± 6%. Более того, было показано, что стерилизация не оказывала влияния на показатели прочности и относительное удлинение (рис. 3). Также стоит отметить, что данные значения показателей механической прочности обеспечивали проведение хирургических манипуляций, что особенно важно при проведении дальнейших исследований in vivo [43].

Исследование цитотоксичности in vitro является критическим первым этапом оценки безопасности любых медицинских изделий. Это позволяет исключить потенциально опасные материалы на ранних стадиях, минимизируя риски для живых организмов и сокращая количество последующих испытаний на животных. В результате проведенного исследования цитотоксического действия образцов пористого биоинженерного скаффолда было показано отсутствие цитотоксического действия полученной конструкции (рис. 4). Статистически значимых различий в количестве погибших клеток относительно контрольных условий на всех сроках наблюдений (24 и 96 ч) выявлено не было. Цитотоксичные компоненты (продукты деградации, остаточные мономеры) провоцируют клеточный стресс, что в живом организме ведет к хроническому воспалению и фиброзу вместо регенерации ткани de novo. Скелетная мышечная ткань обладает ограниченными ресурсами для самовосстановления при объемных повреждениях [44]. Отсутствие цитотоксичности позволяет заключить, что имплантат не будет подавлять пролиферацию и миграцию миобластов и сателлитных клеток, необходимых для формирования новых мышечных волокон [45].

Полученные результаты стали объектом заявки на государственную регистрацию интеллектуальной собственности: получен патент на изобретение «Способ получения биоинженерного скаффолда на основе гидрогеля» [46].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработан пористый биоинженерный скаффолд на основе смеси природных полимеров. Пористая структура образцов скаффолда была получена с помощью комбинации методов послойной заливки / формования с пошаговой заморозкой и контролем структуры с последующим лиофильным высушиванием. Подобран протокол стерилизации разработанной конструкции с помощью этиленоксида, а также было продемонстрировано отсутствие влияния процесса стерилизации на показатели прочности и относительное удлинение. В результате проведенных in vitro тестов на клетках мышиных фибробластов Balb/3Т3 клон А31 и NCTC клон 929 было установлено, что разработанный биоинженерный скаффолд не оказывал цитотоксического действия. Разрабатываемые методы создания биосовместимых конструкций на основе полимерного гидрогеля и способы их модификации позволят расширить спектр препаратов, доступных для клинического применения, что будет способствовать повышению качества жизни пациентов и снижению инвалидизации населения.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: М.М. Боброва — администрирование проекта; А.Л. Лусс — методология эксперимента; П.П. Куликов — концептуализация данных; И.С. Фадеева — написание черновика рукописи и ее редактирование; А.С. Сенотов — проведение исследования; В.В. Минайчев — написание черновика рукописи; А.Ю. Тетерина — верификация данных; М.И. Кобякова — формальный анализ; А.А. Кескинов — руководство исследованием.