Экспрессия генов SPI1 и GATA3 и субпопуляционный состав Т-хелперов у хронически облученных людей

ВВЕДЕНИЕ

Иммунная система человека отличается чрезвычайно высокой радиочувствительностью, а пострадиационные изменения в системе иммунитета у облученных лиц способны длительно сохраняться [1][2]. Наиболее отчетливо это прослеживается у людей, которые подверглись внутреннему облучению в результате депонирования в организме остеотропных радионуклидов, в частности стронция-90 (⁹⁰Sr). Накапливаясь в костной ткани, ⁹⁰Sr продолжительно облучал красный костный мозг (ККМ), который отвечает за образование и развитие клеток крови, включая иммунокомпетентные клетки.

Отдаленные изменения в иммунной системе у хронически облученных жителей прибрежных сел реки Течи включали снижение экспрессии дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов, угнетение функциональной активности Т-клеток, снижение в сыворотке крови содержания ИЛ-4, повышение ФНО-α и ИФН-γ. В совокупности эти изменения характеризуют иммунный ответ, связанный с выраженными воспалительными реакциями [3].

Одним из механизмов, вовлеченным в процесс иммуносупрессии, который обнаружен у облученных лиц, является смещение равновесия между клеточно-опосредованным звеном иммунитета (Th1-ответом) и гуморальным иммунитетом (Th2-ответом) [4]. Т-хелперы 1-го типа (Th1) ответственны за устранение внутриклеточных патогенов и ассоциируются с органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями, в то время как Т-хелперы 2-го типа (Th2) инициируют иммунный ответ на внеклеточных паразитов, таких как гельминты, и играют ключевую роль в развитии астмы и других аллергических заболеваний [5]. Баланс между Т-хелперами 1 и Т-хелперами 2 играет ключевую роль в иммунном ответе. В норме цитокины, вырабатываемые клетками Th2, подавляют продукцию цитокинов Th1 и активность естественных киллеров. В свою очередь, клетки Th1 могут препятствовать дифференцировке и пролиферации базофилов и эозинофилов, функции которых регулируются цитокинами Th2 [6]. Однако при воздействии высоких доз ионизирующего излучения запускаются более выраженные иммуносупрессивные реакции со стороны продукции Тh2-опосредованных цитокинов, в то время как влияние малых доз радиации на баланс Т-хелперных клеток остается спорным [7][8].

Механизмы, контролирующие широкий спектр фенотипов Т-хелперов, особенно в условиях действия неблагоприятных факторов, остаются малоизученными. Тем не менее на сегодняшний день известны несколько ключевых генов, играющих важную роль в регуляции дифференцировки Th1 и Th2 [9].

Транскрипционный фактор PU.1, кодируемый протоонкогеном SPI1, и белок GATA-3, кодируемый одноименным геном GATA-3, участвуют в разнообразных процессах кроветворения и функционирования иммунной системы. В иммунокомпетентных клетках системы они способны запускать активацию ряда факторов, таких как хемокины, цитокины и рецепторы цитокинов, которые регулируют процессы дифференцировки и функционирования Т-хелперных клеток. Взаимодействие PU.1 и GATA-3 способно контролировать иммунное развитие и гомеостаз путем регуляции экспрессии генов, специфичных для субпопуляций Тh1 и Th2 [10].

Принимая во внимание вышесказанное, цель настоящей работы заключалась в изучении экспрессии мРНК генов SPI1 и GATA3, а также субпопуляционного состава Т-хелперов 1-го и 2-го типов у хронически облученных людей в период реализации отдаленных последствий радиационного воздействия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводилось спустя более 65 лет после начала хронического облучения. В качестве объекта исследования выступали мононуклеарные клетки периферической крови, полученные от 98 человек — жителей прибрежных сел реки Течи. Облучение данных людей отличалось низкой интенсивностью, со значением поглощенных доз преимущественно в диапазоне малых и средних, низкой интенсивностью и многолетним облучением красного костного мозга (ККМ) с ярко выраженными компенсаторными механизмами в системе кроветворения. Внутреннее облучение происходило из-за накопления радионуклидов в организме при употреблении речной воды и местных продуктов. Внешнее гамма-излучение было вызвано загрязнением донных отложений и пойменных почв радионуклидами [11].

Участники исследования проходили медицинский осмотр в клиническом отделении Уральского научно-практического центра радиационной медицины Федерального медико-биологического агентства. Биологический материал был получен с согласия пациентов (основание — добровольное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией).

Из исследования были исключены пациенты, находившиеся в период острых или обострения хронических воспалительных заболеваний; имеющие онкологические и аутоиммунные заболевания; принимающие во время обследования антибиотики, гормональные и цитостатические препараты; имевшие контакт с генотоксичными агентами в процессе профессиональной деятельности.

В качестве основных дозиметрических величин, определяющих меры воздействия ионизирующего излучения (ИИ) на организм обследованных лиц, являлись персонализированные дозы облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов, рассчитанные специалистами биофизической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России с использованием дозиметрической системы TRDS-2016 [12].

В соответствии с величиной накопленной дозы облучения ККМ пациенты были разделены условно на две группы: группу сравнения — 45 человек, накопление дозы у которых происходило в течение жизни преимущественно за счет естественного радиоактивного фона, а также медицинских диагностических процедур (накопленные дозы не превышали 55 мГр) и группу хронически облученных лиц — 53 человека, средняя доза облучения красного костного мозга которых составила 782,0 ± 82,3 мГр.

Пациентов, подвергшихся хроническому облучению, разделили на три подгруппы в зависимости от величины накопленной дозы облучения ККМ.

Подгруппа 1. Облученные лица с накопленными дозами на ККМ, не превышающими 500 мГр (n = 20).

Подгруппа 2. Облученные лица с накопленными дозами на ККМ от 500 до 1000 мГр (n = 20).

Подгруппа 3. Облученные лица с накопленными дозами на ККМ более 1000 мГр (n = 13).

Возраст людей из всех подгрупп статистически значимо не различался. В таблице 1 представлена характеристика исследуемых групп, в том числе средний возраст испытуемых и средние дозы облучения, рассчитанные на ККМ, тимус и периферические лимфоидные органы. Обследование проходили лица славянского и тюркского происхождения (татары и башкиры).

Забор крови для оценки относительного содержания мРНК метилтрансфераз был проведен из локтевой вены в объеме 3 мл в стерильные вакуумные пробирки Tempus Blood RNA Collection Tubes (Thermo Scientific™, США). Выделение РНК осуществлялось колоночным методом при помощи коммерческого набора GeneJET Stabilized and Fresh Whole Blood RNA Kit (Thermo Scientific™, США). Количественные и качественные характеристики выделенных образцов общей РНК оценивали при помощи спектрофотометра NanoDrop 2000С (Thermo Scientific™, США). Чистоту препарата определяли по значениям поглощения на длинах волн, равных 260 и 280 нм (А260/280). Реакция обратной транскрипции проводилась отдельным этапом с использованием коммерческого набора реактивов MMLV RT kit («Евроген», Россия). Относительное количественное содержание мРНК определяли с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием амплификатора CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, США). Олигонуклеотидные последовательности праймеров и зондов были разработаны коммерческой компанией ООО «ДНК-СИНТЕЗ». Относительную продукцию генов рассчитывали по методу 2^–ΔΔCt, основанному на расчете количественной оценки экспрессии интересующих генов по отношению к гену «домашнего хозяйства» на основании ПЦР-анализа, проводимого в режиме реального времени [13]. В качестве эндогенного контроля и нормализации данных был использован ген «домашнего хозяйства» ACTB (Actin Beta). Расчет проводился с помощью программного обеспечения прибора Real-Time CFX96 Touch (BioRad, США).

Подробное описание методики исследования субпопуляций Т-хелперов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии было представлено в работе [14]. Для данного исследования были отобраны следующие клеточные популяции: Т-хелперы 1-го типа в популяции Т-хелперов центральной памяти (фенотип CD3⁺CD4⁺CD45RA^-CD62L⁺CXCR5^–CXCR3⁺CCR6^–CCR4^–), Т-хелперы 1-го типа в популяции Т-хелперов эффекторной памяти (фенотип CD3⁺CD4⁺CD45RA^-CD62L^-CXCR5^–CXCR3⁺CCR6^–CCR4^–), Т-хелперы 2-го типа в популяции Т-хелперов центральной памяти (фенотип CD3⁺CD4⁺CD45RA^-CD62L⁺CXCR5^–CXCR3^–CCR6^–CCR4⁺) и Т-хелперы 2-го типа в популяции Т-хелперов эффекторной памяти (фенотип CD3⁺CD4⁺CD45RA^-CD62L^-CXCR5^–CXCR3^–CCR6^–CCR4⁺).

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программного комплекса SPSS Statistics 17.0 и Graph Pad Prism 8.4.3. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с помощью критерия согласия типа Колмогорова — Смирнова. При описании полученных показателей, распределение которых отличалось от нормального, использовали медиану (Ме) и 25–75-й процентили (Q1–Q3). Сравнение выборок данных проводили с использованием U-критерия Манна — Уитни, поскольку распределение большинства значений не соответствовало закону нормального распределения. Для многомерного сравнения использовали критерий Краскела — Уоллиса. Для всех критериев и тестов различия признавали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования получены статистически значимые различия в содержании Т-хелперов 2-го типа, входящих в состав Т-хелперов центральной памяти, в периферической крови у облученных лиц и испытуемых из группы сравнения. Соответствующие данные представлены на рисунках 1А и Б.

Так, у лиц из подгрупп с различной дозой облучения ККМ отмечено статистически значимое снижение абсолютного количества Т-хелперов 2-го типа по сравнению с результатами испытуемых из группы сравнения, а именно: в общей группе облученных лиц — 6,00×10⁹/л (p = 0,03), у лиц из первой подгруппы — 3,63×10⁹/л (p = 0,03), у испытуемых из второй подгруппы — 5,88×10⁹/л (p = 0,02) против 13,14×10⁹/л у испытуемых из группы сравнения. У облученных лиц из подгрупп с различной дозой облучения ККМ также обнаружено статистически значимое снижение относительного количества Т-хелперов 2-го типа по сравнению с аналогичным показателем у лиц из группы сравнения (рис. 1Б).

Вместе с тем обнаружено статистически значимое увеличение соотношения Th1/Th2 в популяции Т-хелперов центральной памяти у лиц из третьей подгруппы — 14,26%, облученных лиц из общей группы — 12,54% относительно показателя у испытуемых из группы сравнения — 7,25% (рис. 2). В то же время в первой и второй подгруппах облученных лиц данный показатель был увеличен относительно испытуемых из группы сравнения лишь на уровне тенденции (p = 0,06 и p = 0,07 соответственно). Для других исследуемых показателей Т-хелперного звена не выявлено статистически значимых межгрупповых различий.

Для установления степени связи между концентрацией Т-хелперов, воздействием радиационных факторов (накопленные дозы облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов), а также возрастом пациентов на время обследования был проведен корреляционный анализ.

В ходе проведенного анализа не было выявлено статистически значимой корреляционной взаимосвязи между абсолютным и относительным количеством Т-хелперов 2-го типа в популяции Т-хелперов центральной памяти и соотношением Th1/Th2 в популяции Т-хелперов центральной памяти с накопленными дозами облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов в объединенной группе исследования. Не было также отмечено статистически значимых корреляционных взаимосвязей между выбранными показателями Т-хелперов и возрастом исследуемых лиц ни в группе сравнения, ни в группе облученных лиц.

Результаты исследования относительной экспрессии генов SPI1 и GATA-3 у обследованных пациентов представлены в таблице 2. Приведенные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что статистически значимых различий в относительном содержании мРНК генов SPI1 и GATA3 у лиц из основной группы и группы сравнения выявлено не было даже по мере увеличения значений накопленной дозы облучения ККМ.

Не выявлено статистически значимых корреляционных связей между относительным содержанием мРНК генов SPI и GATA3 c поглощенными дозами облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов и факторами нерадиационной природы (достигнутого возраста, пола и этнической принадлежности).

У всех хронически облученных лиц не обнаружено статистически значимых корреляционных связей между относительным содержанием мРНК гена SPI1 и абсолютным количеством и частотой Т-хелперных клеток 1-го и 2-го типа в отдаленные сроки после начала радиационного воздействия. При этом в группе облученных людей, чьи накопленные дозы облучения ККМ находились в диапазоне высоких значений (превышали 1000 мГр), обнаружена положительная корреляционная связь между экспрессией гена GATA3 и относительным содержанием Т-хелперов 2-го типа эффекторной памяти (Rs = 0,70; р = 0,02).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Согласно ранее полученным данным, длительное воздействие ионизирующей радиации, даже в диапазоне низких доз, может вызывать снижение клеточного иммунитета на фоне изменений в составе циркулирующих клеток иммунной системы [15].

Т-хелперы относятся к субпопуляциям Т-лимфоцитов и выполняют важную роль в регуляции иммунитета. Опосредуя взаимодействие между иммунокомпетентными клетками, они определяют тип иммунного ответа (клеточный или гуморальный) [16]. В современной литературе появляется все больше данных в пользу индуцированных радиацией изменений в составе и функции субпопуляций Т-клеток, что детерминирует формирование специфического воспалительного профиля иммунной системы, нарушение баланса между субпопуляциями Th1 и Th2, а также изменения уровня экспрессии факторов транскрипции [17].

В результате исследования было выявлено статистически значимое снижение количества T-хелперов 2-го типа в составе популяции Т-хелперов центральной памяти у облученных людей. Наиболее низкие показатели клеточности наблюдались среди лиц, чьи поглощенные дозы находились в диапазоне от 73,4 до 485,1 мГр. В связи с этим у облученных людей было зафиксировано увеличение соотношения Th1/Th2 в популяции Т-хелперов центральной памяти относительно лиц из группы сравнения. Однако данные изменения не были связаны с возрастом или дозой облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов. Аналогичное угнетение Th2-ответа у мышей было продемонстрировано в эксперименте в условиях воздействия низкодозовой радиации [18]. Кроме того, Г. Карими и др., проводившие наблюдение за врачами-радиологами с уровнем облучения менее 50 мГр, отмечали у них сдвиг иммунного ответа в сторону продукции Т-хелперов 1-го типа [19]. Ранее нами также описано снижение количества Т-хелперов 2-го типа, входящих в состав Т-хелперов центральной памяти у лиц, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию [20].

В рамках настоящей работы нами установлено, что в отдаленные сроки после воздействия ИИ у жителей прибрежных сел реки Течи, подвергшихся хроническому облучению, отсутствуют изменения со стороны экспрессии мРНК генов транскрипционных факторов SPI и GATA3. Обращает на себя внимание тот факт, что для лиц, чьи поглощенные дозы облучения ККМ находились в диапазоне высоких значений (более 1000 мГр), характерна статистически значимая положительная корреляционная связь между относительным содержанием мРНК гена GATA3 и Т-хелперами 2-го типа эффекторной памяти. Действительно, белок GATA3 играет важную роль в развитии Th2-фенотипа, активируя секрецию цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13 в Th2-клетках, а также ингибируя специфические транскрипционные факторы Th1, такие как T-bet, NF-AT1, FOXP3 и другие [21].

Результаты, полученные в ходе исследования, не противоречат современным научным данным и показывают, что изменения в иммунной системе у людей, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию, в отдаленные сроки носят невыраженный характер. Необходимо продолжить работу по изучению ключевых факторов транскрипции, участвующих в дифференцировке иммунокомпетентных клеток и обеспечивающих их функционирование у людей, облученных в диапазоне высоких доз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования зафиксировали снижение абсолютного количества Т-хелперов 2-го типа, входящих в состав Т-хелперов центральной памяти, в отдаленные сроки у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию. У людей с накопленными дозами более 1000 мГр наблюдается увеличение соотношения Th1/Th2 в популяции Т-хелперов центральной памяти по отношению к необлученным лицам и положительная корреляционная связь между экспрессией гена GATA3 и относительным количеством Т-хелперов 2-го типа эффекторной памяти.

Полученные результаты подтверждают факт, что радиационно-индуцированные иммунные изменения могут напрямую зависеть от суммарной поглощенной дозы облучения, что определяет перспективы для дальнейшего анализа состояния здоровья людей, подвергшихся хроническому облучению в высоких дозах.