Влияние экстракта простаты быка на сократительную активность лимфатических сосудов крысы

ВВЕДЕНИЕ

Хронический простатит является одним из наиболее распространенных и в то же время недостаточно изученным и плохо поддающимся лечению заболеванием. При этом эпидемиология заболевания такова, что основной целевой популяцией пациентов являются преимущественно лица репродуктивного возраста. Течение хронического простатита нередко осложняется нарушением копулятивной и генеративной функций [1]. В последнее время заболевание все чаще выявляется у пожилых мужчин, иногда в сочетании с доброкачественной гиперплазией простаты [2]. Так, у мужчин в возрасте до 50 лет частота подтвержденного простатита только лишь в 2 раза больше, чем у пациентов старше 50 лет [3].

Предстательная железа имеет хорошо развитое внутриорганное сосудистое русло, включающее в себя кровеносные и лимфатические капилляры и посткапилляры. Сети кровеносных и лимфатических микрососудов образуют микрососудисто-мышечные комплексы с пучками гладких миоцитов в передних отделах предстательной железы и микрососудисто-железистые комплексы с простатическими железами в заднем и латеральном отделах предстательной железы [4]. Нарушение лимфатического оттока в сосудистое русло и застойные явления в железистых структурах занимают ведущее место в патогенезе хронического простатита.

Ввиду полиэтиологичности и многофакторности патогенеза лечение хронического простатита подразумевает комплексный подход, включающий антибактериальную, противовоспалительную терапию, физиотерапевтические процедуры и другие воздействия. Перспективным подходом в лечении хронического простатита является использование биорегуляторных пептидов, выделенных из ткани предстательной железы крупного рогатого скота (КРС) [2]. Впервые биологический эффект простатических пептидов, выделенных из предстательной железы быка, был выявлен в середине 1980-х годов. В экспериментальных условиях было выявлено, что полипептиды из предстательной железы, обладая тропностью к сосудам, повышают антиагрегационную активность сосудистых стенок [5]. Простатические пептиды, как и другие регуляторные пептиды, характеризуются отсутствием видоспецифичности, при этом обладают выраженной тропностью к тканям простаты, что позволяет рассматривать ее в качестве органа-мишени.

На фармацевтическом рынке представлено большое количество лекарственных средств, действующим веществом которых является экстракт простаты быка. Для производства этих лекарственных препаратов используются активные фармацевтические субстанции, внесенные в Государственный реестр лекарственных средств. Технология их производства существенно различается, что в значительной степени определяет особенности их состава и выраженность биологического эффекта [6]. Субстанция-смесь «Простатилен®» производства AO МБНПК «Цитомед», полученная по технологии тангенциальной ультрафильтрации, является активной фармацевтической субстанцией, используемой при изготовлении лекарственного средства (ЛС) «Простатилен®».

Простатилен® — это пептидный препарат, одной из форм выпуска которого являются ректальные свечи. Действующим веществом ЛС «Простатилен®» является комплекс водорастворимых пептидов, полученный из ткани предстательной железы половозрелых быков, с добавлением глицина. Способность ЛС «Простатилен®» восстанавливать реологические свойства крови и улучшать микроциркуляцию в органах-мишенях приводят к нормализации гемодинамики и обеспечивают лечение воспалительных заболеваний предстательной железы [7]. Высокая биодоступность ЛС «Простатилен®» обеспечивается низкой молекулярной массой компонентов пептидной фракции и реализуется пассивным транспортом ЛС через энтероциты слизистой прямой кишки. Пептиды абсорбируются сосудами прямой кишки и оказывают влияние через систему анастомозов на органы малого таза, в том числе на предстательную железу, располагающуюся в анатомической близости от места введения [8]. Отток интерстициальной жидкости, содержащей регуляторные пептиды, обеспечивается адекватной сократительной активностью лимфатических сосудов, чувствительных к действию различных вазоактивных веществ, в том числе эндогенных модуляторов функционального состояния [9–11].

Одну из доступных и информативных экспериментальных моделей, используемых для изучения влияния вазоактивных субстанций на транспортную функцию лимфатической системы, представляют изолированные лимфатические сосуды, обладающие спонтанной ритмической сократительной активностью. В связи с этим оценка влияния комплекса пептидов, являющихся действующим веществом ЛС «Простатилен®», на сократительную активность лимфатических сосудов представляет собой актуальную задачу, решение которой может быть использовано при разработке и оптимизации методов терапии хронического простатита.

Цель исследования — изучить влияние субстанции-смеси «Простатилен®» (далее — Простатилен®) на функциональную активность лимфатических сосудов как потенциальной мишени терапевтического воздействия исследуемого экстракта.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на изолированных сегментах переднего брыжеечного лимфатического протока половозрелых самцов нелинейных белых крыс массой 250–300 г, полученных из филиала НИЦ «Курчатовский институт» ПИЯФ — «Питомник лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область). Содержание и кормление лабораторных животных производилось в соответствии с ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными» от 2016 г. Для исследований применяли здоровых половозрелых животных, прошедших 14-суточный карантин. В помещениях вивария контролировали параметры микроклимата (температуру, относительную влажность, параметры кратности воздухообмена), а также качество кормов и подстилочного материала. Животные находились на стандартном рационе в виде гранулированного корма. В помещениях, где содержались экспериментальные животные, был установлен режим освещения 12 ч день / 12 ч ночь.

Экспериментальное исследование проводилось в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных, используемых в эксперименте (Директива 86/609/ЕЕС), и было одобрено комиссией по биоэтике (протокол №5 от 16.12.2022).

В ходе эксперимента определяли влияние Простатилена® на функциональные параметры работы изолированных лимфатических сосудов крыс ex vivo с использованием многоканального миографа Multi Wire Myograph System DMT 620M (DMT, Дания) согласно методике, описанной ранее [12]. Параметры сократительной активности лимфатических сосудов, к которым относятся уровень тонического напряжения, амплитуда и частота фазных сокращений (ЧС), регистрировали с помощью системы PowerLab Data acquisition system 8/30 (ADInstruments, США) с последующей обработкой в программе «LabChartProUpgrade 7.0».

Тестируемый объект — субстанция-смесь «Простатилен®», а также раствор Простатилена® с содержанием водорастворимых пептидов 11,7% (согласно паспорту производителя). Простатилен® использовался в концентрациях (в расчете на содержание водорастворимых пептидов): 1, 2, 5, 10 мкг/мл и добавлялся в перфузат для определения реактивности лимфатических сосудов. Время экспозиции каждой концентрации составляло 20 минут. В качестве контроля использовался физиологический раствор Кребса — Хензелейта с тем же временем экспозиции.

Статистическую обработку данных проводили с помощью методов описательной и аналитической статистики с использованием программы GraphPad Prism 5.04. За критический уровень значимости принимали p ≤ 0,05. Для описания центральной тенденции использовалось значение медианы, в качестве меры рассеяния — первый (Q1) и третий (Q3) квартили. Данные анализировали с использованием Т-критерия Вилкоксона для связанных выборок. Для выявления межгрупповых различий использовали U-критерий Манна — Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Параметры фазной активности лимфатических сосудов, как и любого биологического объекта, характеризовались определенной вариабельностью (табл. 1), в связи с чем при анализе полученных результатов использовали относительные единицы, характеризующие изменение параметров при действии препарата по сравнению с фоновыми значениями, которые принимались за 100%. При выполнении работы, набор данных проходил параллельно (одновременно) во всех экспериментальных группах.

Результаты экспериментов по оценке влияния Простатилена® на изолированные лимфатические сосуды представлены в таблице 2.

Установлено, что применение Простатилена® в минимальной изучаемой концентрации (1 мкг/мл) в течение 20-минутного периода не оказывало влияния на сократительную активность лимфангионов. При 20-минутном воздействии в концентрациях 2, 5 и 10 мкг/мл Простатилен® вызывал увеличение ЧС от фоновых показателей на 23,7% (p ≤ 0,05), 37,6% (p ≤ 0,05) и 26,8% (p ≤ 0,05) соответственно. Амплитуда сокращений и тонус лимфатических сосудов при воздействии субстанции-смеси во всех изучаемых концентрациях регистрировались на уровне фоновых значений и статистически значимо не отличались от контроля.

Помимо биорегуляторных пептидов в состав Простатилена® входит аминокислота глицин. Являясь неотъемлемой частью дыхательной цепи митохондрий, глицин активно участвует в процессе обновления клеток и их оксигенации, в синтезе белков, в частности трипептида глутатиона, в реакциях детоксикации и обладает широким спектром противовоспалительных, цитопротекторных и иммуномодулирующих свойств [13]. Согласно литературным данным глицин оказывает действие и на объекты сердечно-сосудистой системы — кровеносные и лимфатические сосуды [14–16]. С целью исключения собственного эффекта глицина на брыжеечные лимфатические сосуды были проведены эксперименты с раствором Простатилена®, используемого для изготовления жидкой формы Простатилена® (раствор для внутримышечного введения) и не содержащего глицин. В качестве тестируемой концентрации была выбрана минимальная действующая — 2 мкг/мл (в расчете на содержание водорастворимых пептидов).

Как следует из приведенных в таблице 2 данных, раствор Простатилена® в концентрации 2 мкг/мл приводил к увеличению ЧС лимфангионов на 29,6% (p ≤ 0,05) в сравнении с фоном. При этом амплитуда сокращений и тоническое напряжение регистрировались на уровне фоновых значений. Полученные результаты сопоставимы с результатами, полученными при изучении влияния субстанции-смеси «Простатилена®» на лимфатические сосуды, что доказывает механизм хронотропного эффекта Простатилена®, обусловленного действием биорегуляторных пептидов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Начальные изменения частоты фазных сокращений возникали при влиянии субстанции-смеси «Простатилен®» в концентрации 2 мкг/мл, и с увеличением концентрации Простатилена® эффект возрастал. Максимальное увеличение ЧС наблюдалось при действии Простатилена® в концентрации 5 мкг/мл. При увеличении концентрации субстанции до 10 кг/мл положительный хронотропный эффект на лимфатические сосуды сохранялся. Несмотря на то что рост ЧС был несколько ниже, чем в предыдущей концентрации, это увеличение также статистически значимо отличалось от контроля (p ≤ 0,05). Таким образом, Простатилен® оказывает положительный хронотропный эффект на лимфатические сосуды. Динамика изменений ЧС лимфангионов при воздействии Простатилена® во всех концентрациях представлена на рисунке 1.

ЧС связана с частотой спонтанной генерации потенциалов действия в клетках-пейсмейкерах гладких мышц, а в основе возникновения потенциалов действия лежит спонтанная кратковременная деполяризация (Spontaneous Transitory Depolarization), которая возникает вследствие открытия Ca²⁺-зависимых Cl-каналов при внутриклеточном высвобождении ионов Ca²⁺ из инозитол-1,4,5-трифосфат-чувствительных хранилищ [17]. Можно предположить, что Простатилен® способствует выходу ионов Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ, что, в свою очередь, приводит к увеличению ЧС.

Для изучения устойчивости полученного стимулирующего эффекта Простатилена® было проанализировано изменение ЧС в период «отмывания», когда в рабочую камеру миографа поступал перфузируемый раствор Кребса — Хензелейта без действующего вещества. По истечении 30-минутного периода отмывания после действия Простатилена® в концентрации 10 мкг/мл частота фазной сократительной активности превышала фоновые показатели на 30,1% (p ≤ 0,05), что свидетельствует о пролонгированном действии препарата. Такой эффект последействия биорегуляторных пептидов может быть объяснен теорией И.П. Ашмарина о функциональной непрерывности и регуляторном континууме системы регуляторных пептидов [18]. Внутриклеточные процессы, следующие за рецепцией пептидов, связаны с действием последних на системы вторичных мессенджеров, которые запускают, в свою очередь, внутриклеточный каскад последовательной активации ферментов, что, в конечном счете, проявляется в виде изменения метаболических процессов в клетке и обусловливает физиологический ответ. Принципиально важно, что биорегуляторные пептиды способны запускать после взаимодействия с рецептором ряд процессов на всех уровнях метаболической иерархии клеток (от мембраны до генома) с различной продолжительностью — от минут (долей минут) до часов. Это делает возможным существование каскадных эффектов в организме, вызванных введением или высвобождением того или иного биорегуляторного пептида [19].

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенного исследования впервые было показано, что субстанция-смесь «Простатилен®» проявляет вазоактивные свойства в отношении лимфатических сосудов. В диапазоне концентраций 2—10 мкг/мл Простатилен® стимулирует моторику лимфангионов, что позволяет рассматривать изолированные лимфатические сосуды в качестве адекватной физиологической модели для исследования вазоактивных свойств препарата.
2. По результатам проведенной работы можно предположить, что водорастворимые биорегуляторные пептиды, входящие в состав ЛС «Простатилен®», не только обладают направленным (органотропным) действием на предстательную железу и органы мочеполовой системы, но и могут способствовать снижению отека ткани путем активации моторики лимфатических сосудов органов малого таза, что еще раз подтверждает целесообразность применения регуляторных пептидов при лечении заболеваний, ассоциированных с воспалительными и застойными явлениями.