Механизмы потенцирования тепловым стрессом летального действия фентанила на крыс

ВВЕДЕНИЕ

Как правило, доклинические исследования лекарственных средств проводят при температуре воздуха 20–24 °С, регламентированной Руководством по содержанию и уходу за лабораторными животными¹. Поэтому влияние теплового стресса на биологическую активность ряда лекарственных средств слабо представлено в научной литературе, в то время как он служит возможным фоном их реального применения, особенно на догоспитальном этапе. Это определяет актуальность изучения биологической активности лекарственных препаратов в климатических условиях, способствующих перегреванию организма.

Ранее мы показали [1], что внутривенное введение (при температуре воздуха 20–24 °С) крысам фентанила в дозах, не превышавших LD₅, абсолютно летально при последующем сорокаминутном их содержании в условиях температуры воздуха 40 °С, хорошо переносимой без воздействия фентанила.

Для объяснения этого ранее неизвестного феномена были выдвинуты гипотезы о гипераммониемии и обусловленном ею набухании головного мозга как механизмах отягощающего влияния теплового стресса на острую интоксикацию фентанилом.

Цель исследования — проверка гипотез о механизмах повышения токсичности фентанила для крыс в условиях теплового стресса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили с января по май 2025 г. на беспородных самцах крыс-альбиносов (191–210 г), приобретенных в Филиале НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ — ПЛЖ «Рапполово». Выполнили 2 серии экспериментов.

В первой серии (n = 77) изучали влияние изолированного или совместного воздействия фентанила и теплового стресса на ректальную температуру, массу тела и головного мозга, содержание в нем глутамина, биохимические показатели крови из a. carotis communis и v. jugularis interna. Схема исследования и распределение животных на экспериментальные группы представлены в таблице 1.

Во второй серии экспериментов на других крысах (n = 37), аналогичных использовавшимся в первой серии, изучали влияние изолированного или совместного воздействия фентанила и теплового стресса на потребление кислорода гомогенатами головного мозга. Схема исследования представлена в таблице 2.

Раствор фентанила 50 мкг/мл (ФГУП «Московский эндокринный завод», серия 30212) вводили животным в объеме 4 мл/кг в латеральную вену хвоста. Доза фентанила составляла 200 мкг/кг, что, согласно ранее полученным данным [1], соответствовало LD_5/24 ч при 22 °С и LD_70/24 ч при 40 °С в течение 40 мин и далее при 22 °С.

Тепловой стресс моделировали в термокамере BMT Stericell SC 111 ECO объемом 111 л (Чехия), в которой поддерживали температуру воздуха 40 ± 1 °С, относительную влажность 48% и кратность воздухообмена 45 объемов камеры в час. Во время пребывания в термокамере все животные находились в рестрейнерах из перфорированного алюминия. Крыс, не получивших фентанил и оставленных в рестрейнерах при комнатной температуре, рассматривали как интактных. Температуру тела измеряли с точностью до 0,1 °С электрическим термометром с датчиком для крыс RET-2 (WPI, КНР), наконечник которого вводили в rectum на глубину 3 см. Массу тела измеряли с точностью до 1 г до и через 40 мин после введения животным растворов. Оценивали цвет глазного дна животных, о котором косвенно судили по цвету глаз у крыс-альбиносов, лишенных иных пигментов, кроме гемоглобина.

В первой серии экспериментов крыс для забора крови фиксировали в дорсальном положении; не получивших фентанил подвергали легкому фторотановому наркозу. Проводили забор крови в объемах по 0,5–1 мл из a. carotis communis и v. jugularis interna, плазму отделяли центрифугированием в течение 10 мин на холоде при 3000 об/мин (5400 g). На биохимическом анализаторе А-25 фирмы «BioSystems» (Испания) определяли аммиак с помощью набора реактивов «Ammonia Ultra» (Sentinel Diagnostics, Италия), креатинин в реакции с пикриновой кислотой, используя набор реактивов «Креатинин-Ново-А» (АО «Вектор-Бест», Россия), и молочную кислоту с использованием набора реактивов «Лактат-витал» (АО «Витал Девелопмент Корпорэйшн», Россия).

По окончании забора крови животных декапитировали, головной мозг извлекали и взвешивали с точностью до 0,01 г до и после высушивания до постоянной массы при 105 °С. Высушенный головной мозг измельчали до порошкообразного состояния, суспендировали в девяти частях 0,01 М фосфатного буферного раствора (pH = 7,0), перемешивали и центрифугировали при 20 000 об/мин (36 000 g) в течение 1 ч при 4 °С. Супернатант инкубировали 10 мин при 100 °С в присутствии серной кислоты в конечной концентрации 0,17 М; до и после инкубации в нем определяли аммиак указанным выше методом. Концентрацию глутамина в экстракте ткани определяли по разности концентраций аммиака в супернатанте до и после кислотного гидролиза [2]; для построения калибровочного графика использовали L-глутамин (Merck, Германия). Рассчитывали содержание глутамина в сухой ткани в мкмоль/г.

Во второй серии экспериментов головной мозг извлекали, взвешивали и гомогенизировали в холодном растворе Хенкса, не содержавшем фенолового красного, до получения однородной взвеси, в которой на одну массовую долю сырой ткани приходилось четыре массовые доли раствора Хенкса. По 1 мл полученного 20% гомогената вносили в манометрические сосуды, содержавшие по 2 мл раствора Хенкса без фенолового красного в основном и 0,2 мл 10% раствора гидроксида калия — в центральном отсеках. Потребление кислорода измеряли манометрическим методом [3] в аппарате Варбурга Wa 0110 фирмы Glaswerke Ilmenau (Германия) при температуре 38 °С и темпе качаний шейкера 120 мин⁻¹; газовой фазой служил воздух. Показания манометров регистрировали после десятиминутного выравнивания температур и далее с интервалом 10 мин в течение 70 мин. Потребление кислорода выражали в микролитрах на 1 г сырой ткани нарастающим итогом.

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения OriginPro. Результаты представляли в виде среднего значения и его ошибки (M ± m). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро – Уилка. Влияние применявшихся воздействий на параметрические показатели оценивали с помощью дисперсионного анализа. В случаях значимости полученных моделей межгрупповое сравнение средних величин выполняли с помощью теста честной значимой разницы Тьюки. Критический уровень значимости α приняли равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Через несколько секунд после введения фентанила у крыс возникали опистотонус, экстензия хвоста, крат­ковременное апноэ с последующим редким поверхностным дыханием и выраженный цианоз глазного дна. Отсутствие аудимоторного и болевого рефлексов позволяло квалифицировать неврологический статус животных как кому.

В первой серии экспериментов летальность получивших фентанил крыс за 40 мин пребывания при 22 °С составила 9%, а при 40 °С — 71%. Для крыс, не получивших фентанил, сорокаминутное пребывание при 40 °С было нелетальным; их поведение по извлечении из термокамеры выглядело обычным, глазное дно имело ярко-алый цвет.

У выживших крыс исходное значение ректальной температуры составило 38,0 ± 0,1 °С (n = 44). Через 40 мин после введения фентанила ректальная температура особей, оставленных при 22 °С, была снижена до 33,9 ± 0,2 °С (n = 10), а у помещенных в термокамеру — повышена до 42,9 ± 0,3 °С (n = 12). Помещение в термокамеру без введения фентанила повышало ректальную температуру до 42,7 ± 0,3 °С (n = 10). Перечисленные изменения представлены на рисунке 1А.

За 40 мин после введения фентанила масса тела оставленных при 22 °С крыс снижалась с 203 ± 5 до 198 ± 5 г при тенденции к снижению у интактных животных. Пребывание в термокамере без введения фентанила снижало массу тела с 200 ± 4 до 190 ± 4 г, а у выживших особей после введения фентанила — с 201 ± 5 до 192 ± 5 г. Изменения массы тела представлены на рисунке 1Б.

Абсолютная масса извлеченного головного мозга, равно как и ее отношение к исходной массе тела крыс, получивших фентанил и/или переживших тепловой стресс, существенно не различалась с таковыми у интактных животных. Отношение массы головного мозга к массе тела через 40 мин после введения фентанила и/или помещения в термокамеру имело тенденцию к увеличению во всех группах в сравнении с интактной. Для особей, после введения фентанила находившихся в термокамере, эта тенденция была значимой и проявлялась превышением на 7,4% относительной массы их головного мозга таковой у интактных крыс (рис. 2А).

У интактных крыс влагосодержание головного мозга составляло в среднем 79,4%, при изолированном действии фентанила — 79,2%, при изолированном перегревании — 78,9%, при перегревании на фоне действия фентанила — 79,5%; его межгрупповые различия не были статистически значимы. Относительная масса сухого мозга после воздействия фентанила и теплового стресса превысила таковую у интактных крыс на 7,2%, а при изолированном тепловом воздействии — на 8,9% (рис. 2Б).

В экстракте сухой ткани головного мозга содержание свободного аммиака было ниже порога чувствительности метода (15 мкмоль/л), однако после кислотного гидролиза он определялся в количестве, эквивалентном содержанию глутамина. У интактных крыс содержание глутамина в сухой ткани мозга составляло 21,8 ± 1,5 мкмоль/г, что в расчете на сырую ткань соответствовало 4,5 мкмоль/г и согласовывалось с литературными данными [4]. В сухой ткани головного мозга при изолированном тепловом стрессе или его комбинации с действием фентанила содержание глутамина было повышено в сравнении с интактными животными на 43 и 46% соответственно (рис. 2В).

На фоне совместного действия фентанила и теплового стресса уровень аммиака в крови был повышен в сравнении с интактными животными в 2–2,2 раза. Значение артериовенозного градиента концентрации аммиака в плазме крови у всех животных было положительным. На фоне изолированного теплового стресса он составлял, как и у интактных крыс, 47 ± 13 мкМ, а на фоне изолированного или совместного с перегреванием действия фентанила имел тенденцию к повышению: 87 ± 29 и 61 ± 18 мкМ соответственно (рис. 3А).

Концентрация креатинина в плазме артериальной и венозной крови во всех опытных группах превышала таковую у интактных крыс в 1,6–2,4 раза. Наибольшим (в 2,2–2,4 раза) это превышение было в условиях теплового стресса (рис. 3Б).

На фоне теплового стресса уровень молочной кислоты в плазме артериальной и венозной крови был выше, чем у интактных крыс, на 25–45%, а при перегревании на фоне введения фентанила — на 50–60%. Содержание лактата в артериальной крови превышало его концентрацию в венозной крови у всех животных, кроме подвергшихся изолированному тепловому стрессу (рис. 3В).

Во второй серии экспериментов изолированное воздействие фентанила или теплового стресса было нелетальным, а при их комбинации погибли до извлечения из термокамеры 13 (68%) из 19 крыс.

Значение интенсивности дыхания гомогенатов головного мозга во всех экспериментальных группах было стабильным, что обеспечивало линейную динамику объема потребленного кислорода. Для интактных животных она описывалась уравнением линейной регрессии y = 3,83 x, при изолированном действии фентанила — y = 3,71 x, при изолированном тепловом стрессе — y = 3,41 x, а при совместном действии этих агентов — y = 4,09 x, где x — продолжительность инкубации, мин; y — удельный объем потребленного кислорода, мкл на 1 г ткани. Среднее за 70 мин потребление кислорода составляло в интактной группе 3,8 мкл/(г×мин). При изолированном тепловом стрессе оно было меньшим на 10%, а при тепловом стрессе на фоне действия фентанила — большим на 7%, чем у интактных крыс (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

В термокамере ректальная температура крыс повышалась, что отражало формирование теплового стресса. Вопреки наблюдавшемуся в настоящей работе и описанному в литературе [5] гипотермическому эффекту фентанила, через 40 мин пребывания в термокамере у получивших его крыс, как и при изолированном тепловом воздействии, температура тела приближалась к 43 °С — порогу необратимого повреждения биотканей [6]. Однако летальность наблюдали лишь на фоне введения фентанила, вследствие чего она не была обусловлена термическим повреждением биотканей или уменьшением сродства гемоглобина к кислороду с ростом температуры тела. По этой же причине летальность не была детерминирована и обезвоживанием организма: как потеря воды, приводившая к снижению массы тела, так и гемоконцентрация, проявлявшаяся накоплением креатинина в крови, были сопоставимы у животных, получивших и не получивших фентанил. Повышение вследствие обезвоживания вязкости крови могло затруднять кровоснабжение головного мозга, но при отсутствии фентанила не было летальным.

Гипотеза о вовлеченности набухания головного мозга в отягощающий эффект теплового стресса при острой интоксикации фентанилом не получила экспериментального подтверждения. У крыс, остававшихся живыми через 40 мин после начала совместного действия этих факторов, увеличение относительной массы сырого и сухого головного мозга было сопоставимым (на 7,4 и 7,2%), а влагосодержание существенно не изменялось, что указывает на отсутствие у них выраженных отека, набухания или гиперемии головного мозга.

В условиях теплового стресса обезвоживание головного мозга было менее выраженным, чем организма в целом, что видно по увеличению его относительной массы при стабильности абсолютной массы. Поскольку масса биоткани положительно связана с ее объемом, отношение объемов головного мозга и полости черепа при тепловом воздействии могло возрастать, вызывая повышение внутричерепного давления. Передаваясь в соответствии с законом Паскаля на кровеносные сосуды, избыточное гидравлическое давление затрудняло бы мозговой кровоток. Однако сопоставимая выраженность увеличения относительной массы головного мозга крыс, до помещения в термокамеру получивших и не получивших фентанил, при выживании лишь последних, не позволяет считать повышение внутричерепного давления ведущим звеном танатогенеза.

Под влиянием фентанила и/или теплового стресса в головном мозге накапливался глутамин. В расчете на 1 г сырой ткани его среднегрупповое содержание было больше, чем у интактных крыс, на 0,2, 1,0 и 1,0 мкмоль за 40 мин после введения фентанила, помещения в термокамеру или комбинации этих факторов соответственно. Поскольку посмертный синтез глутамина в ткани мозга невозможен в силу остановки окислительного фосфорилирования уже через 10,5 с после декапитации [7], этот прирост отражал направленность прижизненных изменений основной реакции обезвреживания аммиака головным мозгом: синтеза глутамина глутаминсинтетазой астроцитов [8]. Сопоставимая выраженность накопления глутамина в головном мозге крыс, до помещения в термокамеру получивших и не получивших фентанил, позволяет исключить это нарушение из числа летальных.

Положительный артериовенозный трансцеребральный градиент концентрации аммиака в плазме крови всех крыс соответствовал данным литературы [8] и указывал на то, что основным источником глутамина в ткани мозга был аммиак, экстрагированный из крови. Каждый миллилитр крови интактных или подвергшихся изолированному тепловому стрессу животных при переходе из общей сонной артерии во внутреннюю яремную вену терял 47 нмоль аммиака. При изолированном действии фентанила эта потеря составила 87 нмоль, а при совместном действии фентанила и теплового стресса — 61 нмоль. Объемная скорость церебрального кровотока крыс оценивается в 1,3 мл/(г×мин) [9]. При допущении о неизменности мозгового кровотока это позволяет рассчитать количество аммиака, абсорбированного тканями головы (преимущественно головным мозгом) из крови: 2,4; 4,5; 2,4 и 3,2 мкмоль в расчете на 1 г ткани за 40 мин для интактных, получивших фентанил, подвергшихся тепловому стрессу или совместному действию обоих факторов соответственно. Однако эти данные не обнаруживают закономерной связи с межгрупповыми различиями летальности.

Прирост содержания глутамина в ткани головного мозга не обеспечивал связывания всего абсорбированного из крови аммиака. Остальная его часть, за 40 мин преодолевшая гематоэнцефалический барьер, может быть найдена вычитанием прироста содержания глутамина в ткани из количества абсорбированного ею аммиака и составляет 2,4; 4,3; 1,4 и 2,2 мкмоль в расчете на 1 г ткани для интактных, получивших фентанил, подвергшихся тепловому стрессу или совместному действию обоих факторов соответственно. В нейронах аммиак стехиометрически вовлекается в состав глутаминовой и других аминокислот. Поскольку указанные значения его количества на порядок превышают содержание в нервной ткани пировиноградной (0,06–0,13 мкмоль/г) и α-кетоглутаровой (0,12–0,19 мкмоль/г) оксокислот [10], их аминирование с образованием аланина и глутамата могло снизить доступность для ткани мозга этих интермедиатов энергетического обмена. Снижению доступности пирувата могло способствовать и его карбоксилирование с образованием оксалоацетата: этот процесс стимулируется низкой концентрацией оксалоацетата, связанной с концентрацией α-кетоглутарата; избыток аммиака в тканях приводит к аминированию именно этих кетокислот. Истощающее влияние аммиака на пул интермедиатов цикла Кребса в нейронах, запускающее каскад их повреждения, некоторыми авторами рассматривается как ведущий механизм его нейротоксичности [11]. Другим механизмом нейротоксичности аммиака, избежавшего вовлечения в состав глутамина, могло быть накопление в мозге эксайтотоксического агента — глутамата [12]. Как видно из полученных данных, межгрупповые различия расчетных значений количества аммиака, участвовавшего в этих процессах, не могли объяснить потенцирование острой токсичности фентанила тепловым стрессом.

Повышение уровня аммиака в крови в 2,0–2,2 раза, отличавшее крыс после совместного воздействия фентанила и теплового стресса от подвергшихся их изолированному воздействию, рассматривается как нелетальное [8]. Однако можно предположить, что у животных, павших до извлечения из термокамеры, гипераммониемия была более выраженной, чем у остававшихся живыми. Кроме того, гипераммониемии сопутствовали гипоксемия, на которую указывал цианоз глазного дна, и метаболический ацидоз, маркером которого была лактацидемия. Наличие обоих этих нарушений и максимальная выраженность лактацидемии отличали животных, подвергшихся совместному воздействию фентанила и теплового стресса, от подвергшихся их изолированному воздействию. Гипоксия и метаболический ацидоз увеличивают токсичность аммиака [13][14]. Как видно, гипераммониемия в сочетании с гипоксемией и лактацидемией снижала выживаемость крыс в условиях воздействия фентанила и теплового стресса.

Потребление кислорода аэробными клетками — интегральный показатель их метаболической активности [15]. Потребление кислорода клетками головного мозга измеряли in vitro при отсутствии субстратных ограничений и на фоне выключенной АТФ-зависимой функции генерации и проведения нервного импульса; оно составляло 3,4–4,1 мкл на 1 г ткани в минуту, что на порядок меньше, чем in vivo: 33 мкл на 1 г ткани в минуту [7]. Полученные данные не выявили у крыс, выживших после воздействия фентанила и теплового стресса, нарушений клеточного дыхания, которые препятствовали бы удовлетворению энергетических потребностей нервной ткани в указанных благоприятных условиях. Интенсификация потребления кислорода гомогенатами головного мозга таких животных имела компенсаторный характер и отражала состояние энергетического голодания, в котором находилась ткань головного мозга перед декапитацией. Судя по наличию лактацидемии и признаков гипоксемии у таких животных, в ткани их мозга накапливались положительные модуляторы клеточного дыхания: АДФ, АМФ и фосфат [16]. Поскольку для приготовления гомогенатов ткань разбавляли в 15 раз, стимулирующий эффект этих веществ проявлялся лишь в ослабленном виде. При изолированном действии фентанила перечисленные нарушения могли смягчаться снижением потребности головного мозга в АТФ на фоне комы [17], что является вероятной причиной отсутствия существенных изменений потребления кислорода гомогенатами головного мозга. На отсутствие энергетической задолженности ткани мозга таких животных указывало отсутствие у них существенных изменений содержания лактата в крови и его артериовенозного градиента. У крыс, подвергшихся изолированному тепловому стрессу, ярко-алый цвет глазного дна свидетельствовал об интенсивном мозговом кровотоке и высокой сатурации кислородом гемоглобина артериальной крови. У таких животных более низкое, чем у интактных крыс, потребление кислорода клетками головного мозга in vitro могло отражать накопление в них отрицательного модулятора клеточного дыхания — АТФ.

Полученные данные показывают, что триада метаболических нарушений, включающая лактацидемию, гипоксемию и гипераммониемию, опосредует отягощение тепловым стрессом острой интоксикации фентанилом у крыс. В то время как возникновение первых двух компонентов этой триады при гипертермии и нарушении внешнего дыхания ожидаемо, механизмы гипераммониемии предстоит идентифицировать. В свете концепции клеточного стресса [18], с учетом его влияния на кишечную проницаемость [19], уместна оценка роли энтерогематического барьера в формировании гипераммониемии при перегревании организма на фоне острой интоксикации фентанилом.

ВЫВОДЫ

1. Моделирование микроклиматических условий, вызывающих нелетальное острое перегревание организма, повышало токсичность фентанила для крыс с увеличением летальности за 40 мин до 68–71% против 0–9% при комнатной температуре.
2. Потенцирование тепловым стрессом летального действия фентанила на крыс не было обусловлено необратимым термическим повреждением биотканей, обезвоживанием организма, отеком, набуханием, гиперемией головного мозга или накоплением в нем глутамина.
3. Гипоксемия, лактацидемия и гипераммониемия были необходимыми условиями отягощающего влияния условий, способствующих перегреванию организма, на острую интоксикацию фентанилом у крыс.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Ю.Ю. Ивницкий — научный замысел, разработка плана исследования, семантика, трактовка данных, написание черновика рукописи; Е.О. Демидова — выполнение морфометрических исследований; О.А. Вакуненкова — руководство экспериментальной частью работы; Е.А. Золотоверхая — модификация методов и проведение биохимических исследований; А.И. Головко — поиск литературных источников, анализ данных об актуальных проблемах доклинических исследований. Все авторы участвовали в обсуждении результатов, подготовке и редактировании окончательного варианта рукописи статьи.