Корреляция параметров протеома крови с количеством некоторых бактерий кишечной микрофлоры у здоровых женщин

ВВЕДЕНИЕ

Нормальная микрофлора кишечника человека представлена широким спектром микроорганизмов, большинство из которых являются облигатными или факультативными анаэробами. Оппортунистические инфекции могут возникать непосредственно из-за облигатных возбудителей или косвенно из-за чрезмерного роста условно-патогенных микроорганизмов (УПМ); важную роль в этом играет и истощение популяции кишечных комменсалов (КК) [1]. Известно, что факторы космического полета, например измененный режим питания, гигиенических процедур, психоэмоциональное напряжение, постоянный микробный обмен, неизбежно возникающий в гермозамкнутом помещении космического корабля, негативно влияют на состав кишечной микробиоты, при этом отмечается активное размножение условно-патогенного компонента микрофлоры и снижение количества протективных видов микроорганизмов [2]. Это определяет необходимость разработки средств профилактики и снижения рисков развития дисбиотических состояний, а также проведения исследований для углубленного понимания взаимосвязей кишечной микробиоты и иных физиологических и биохимических показателей здоровья человека, что впоследствии позволит влиять на состав кишечной микробиоты через точечные воздействия на отдельные процессы в организме, например на метаболизм отдельных белков.

Подавляющее большинство бактерий обитает в толстом кишечнике. В проксимальных отделах тонкого кишечника в норме содержится до 10⁴ КОЕ/мл микроорганизмов, что связано с pH среды (7,2–7,6) и бактерицидным действием желчи. Комменсальная микрофлора кроме участия в процессах пищеварения обладает целым спектром важных для организма хозяина функций. Она осуществляет неспецифическую противовоспалительную защиту через продукцию бактериоцинов, органических кислот и веществ с бактериостатическими свойствами, стимулирует эукариотические клетки к синтезу муцина и веществ с антимикробной активностью. Кроме того, сообщество комменсальной микрофлоры направленно подавляет развитие воспалительных реакций в клетках эпителия кишечника. Очевидно, эти представители микрофлоры кишечника действуют синергично с местной иммунной системой [3][4].

Следовательно, кишечник человека является не только важной частью пищеварительной системы для переваривания пищи, всасывания воды и питательных веществ, он также играет существенную роль в организации иммунной защиты [5]. Эпителиальные клетки слизистой оболочки кишечника задействованы в иммунной регуляции. В собственной пластинке слизистой оболочки кишечника присутствуют Т- и В-клетки, защищающие организм от проникновения патогенов. Помимо этого, клетки слизистой оболочки кишечника продуцирует различные цитокины, такие как гамма-интерферон (IFN-γ), фактор некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкин 2 (IL-2) и интерлейкин 6 (IL-6), которые являются важными регуляторами как физиологических адаптивных реакций, так и врожденных иммунных реакций [6]. В частности, они могут участвовать в воспалительных реакциях и опосредовать дифференцировку, пролиферацию и активацию различных иммунных клеток [7]. Более того, кишечная микрофлора необходима для организации и осуществления различных иммунных реакций [8]. Так, микрофлора кишечных комменсалов активирует как врожденный, так и адаптивный иммунитет в клетках слизистой оболочки кишечника [9].

В настоящем исследовании нами предпринята попытка проанализировать возможную взаимосвязь комплекса белков в крови с количеством ряда бактерий кишечника женщин, участвующих в эксперименте с 3-суточной «сухой» иммерсией [10].

В проведенных ранее исследованиях микрофлоры кишечника у людей в эксперименте «сухой» иммерсии было выявлено существенное ухудшение состояния микрофлоры: увеличение доли УПМ, снижение количества КК [11].

По мнению некоторых исследователей, регуляторные и метаболические изменения, происходящие во время экспериментов с «сухой» иммерсией, отражаются и на белковом составе крови. Исследования, выполненные методами протеомики на основе масс-спектрометрии, выявили изменения уровней плазминогена, фибронектина, других факторов свертывания и фибринолиза, повышение содержания продуктов фибринолиза, активацию системы комплемента [12]. Очевидно, что протеомные методы позволяют определить белки, реагирующие на сложный комплекс факторов «сухой» иммерсии, и уточнить молекулярные механизмы изменений в различных физиологических системах.

Цель исследования — выявление взаимосвязи между уровнем белков в крови человека и количеством E. coli, Lactobacillus spp., Enterococcus spp. и Bifidobacterium spp. в кишечнике с применением экспериментальной модели 3-суточной «сухой» иммерсии для потенциального использования в качестве клинических рекомендаций по коррекции микрофлоры кишечника, основываясь на данных протеомного профиля крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн эксперимента

В эксперименте «сухой» иммерсии продолжительностью 3 сут приняли участие 6 женщин в возрасте от 25 до 40 лет. Во время эксперимента все испытуемые не принимали антибактериальные препараты и иные средства, способные оказать влияние на колебания уровней микрофлоры. В начале эксперимента все участницы были распределены по фазе менструального цикла (фолликулярная фаза), чтобы избежать различий в уровнях эстрадиола и его эффектов на микрофлору и белки плазмы. Во время периода «сухой» иммерсии испытуемые не подвергались никаким дополнительным воздействиям, направленным на предотвращение адаптивных изменений в физиологических системах [10].

Эксперимент «сухая» иммерсия является одним из методов имитации таких факторов, воздействующих на организм в космическом полете, как гипогравитация, опорная разгрузка, перераспределение жидких сред организма в краниальном направлении. Во время «сухой» иммерсии испытуемые женщины находились в иммерсионной ванне полностью погруженными в воду комнатной температуры, но благодаря водонепроницаемой пленке соприкосновения кожи испытуемых с водой не происходило, что позволяло увеличивать время пребывания в ванне (рис. 1).

Исследование было проведено на стендовой базе «Сухая иммерсия» ИМБП РАН. В течение всего эксперимента участницы находились в горизонтальном положении без физических нагрузок с ограничением произвольных движений.

Сбор образцов кала, культивирование и идентификация представителей кишечной микрофлоры

Сбор образцов сухих пятен крови

Забор образцов капиллярной крови объемом 20 мкл для проведения хромато-масс-спектрометрического анализа проводили с помощью автоматического скарификатора путем прокола концевой фаланги безымянного пальца с последующим нанесением на специальные фильтры (Perkin Elmer) для высушивания (метод «сухого пятна»). Образцы крови собирали у добровольцев за 2 сут до начала эксперимента и в динамике на 1-е, 2-е, 3-и сут во время «сухой иммерсии», а также через 2 сут после ее окончания. Пробы капиллярной крови после сбора были высушены при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем хранили высушенные образцы пятен крови при -20 °C.

Сухие пятна крови готовили к хромато-масс-спектрометрическому анализу для определения белков в крови человека следующим образом: белки экстрагировали в буфере, содержащем 25 мМ бикарбоната аммония, 1% дезоксихолата натрия и 5 мМ TCEP (трис-(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид) (Thermo Scientific), при температуре 60 °С со скоростью встряхивания 1000 оборотов в минуту (термомиксер, Eppendorf) в течение 1 часа, затем восстанавливали, алкилировали, осаждали и расщепляли трипсином, как описано в методике [14].

Хромато-масс-спектрометрический анализ экстрактов сухих пятен крови

Смеси триптических пептидов разделяли с помощью жидкостной хроматографии на основе нано-ВЭЖХ Dionex Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, США), затем анализировали на масс-спектрометре TimsTOF Pro (Bruker Daltonics, США) с использованием метода параллельного накопления при последовательной фрагментации (PASEF) [15].

Статистический анализ

Статистический анализ полученных данных проведен с использованием ряда непараметрических методик. Изменения в кишечной микрофлоре оценивали с помощью непараметрического критерия Краскела — Уоллиса для связанных выборок. Вычисляли эубиотический индекс, который выражается в суммировании положительных и отрицательных количественных изменений протективных и условно-патогенных групп микроорганизмов и отражает позитивные сдвиги в составе микрофлоры. Статистическая обработка эубиотического индекса проводилась с помощью парного двухвыборочного t-теста для средних.

Изменение количества белков в крови оценивали с помощью дискриминантного анализа для малых выборок. Связь между уровнем белков в крови человека и численностью ряда бактерий кишечника была адекватно описана с помощью регрессионной модели, в которой в качестве зависимой переменной выступало количество ряда бактерий, в качестве независимой — количество белков [16]. Обработку результатов осуществляли с помощью пакета программного обеспечения Statistica 12.0. За критический уровень значимости принимали p ≤ 0,05. Для визуализации взаимосвязей белков использовалась база данных STRING.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В образцах сухих пятен крови женщин-добровольцев идентифицировали порядка 1256 белков с определением их относительных уровней с использованием безметкового метода количественной оценки (label free quatification). Регрессионная модель показала связь между количеством ряда белков в крови, описанных ниже, и численностью бактерий E. coli, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Enterococcus faecium.

В результате проведенного регрессионного анализа была выявлена взаимосвязь ряда белков с количеством кишечной палочки (E. coli) (рис. 2). Количество белка ENO1 (альфа-енолаза) в крови положительно коррелировало с количеством кишечной палочки (r = 0,71), в то время как для белков MYH9 (немышечный миозин с тяжелой цепью IIa), ACLY (АТФ-цитратлиаза), DPP3 (дипептидилпептидаза 3), SPTA1 (альфа-цепь спектрина) была выявлена сильная отрицательная корреляционная связь r = -0,99 (p ≤ 0,05).

С количеством бифидобактерий (Bifidobacterium spp.) в кишечнике статистически значимо коррелировали белки EPB41 (мембранный белок эритроцитов band 4.1), A1BG (альфа-1-B гликопротеин), VCP (валозин-содержащий белок), C8B (бета-цепь С8 комплемента) и CCT2 (бета субъединица Т-комплекса), r = 0,74 (p ≤ 0,05), также слабая отрицательная корреляция r = -0,46 (p ≤ 0,05) наблюдалась для белков FAH (фермент фумарилацетоацетат гидролаза) и YWHAE (белок активации тирозин-3-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы эпсилон). Соответствующие данные представлены на рисунке 3.

В ходе проведенного исследования при анализе данных была выявлена достоверная сильная положительная корреляционная взаимосвязь между количеством лактобацилл и белков в крови испытуемых ENO1, CA2 (r = 0,74) и отрицательная корреляционная связь между количеством Lactobacillus spp. и белками S100A6 и HSPA4 (r = -0,87). Также была выявлена отрицательная корреляционная зависимость между белком CALM2 (кальмодулин) в крови с количеством энтерококков в кишечной флоре (r = -0,76) (p ≤ 0,05). Обобщенные данные о выявленной корреляционной зависимости белков с некоторыми представителями кишечной микрофлоры приведены в таблице 1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведенного регрессионного анализа была выявлена взаимосвязь ряда белков с количеством кишечной палочки. В крови количество белка ENO1 (альфа-енолаза — гликолитический фермент, катализирующий превращение 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват) положительно коррелирует с количеством кишечной палочки. Основными функциями данного белка являются участие в гликолизе, процессах клеточного роста и аллергических реакциях. Кроме того, данный белок служит рецептором на поверхности лейкоцитов и стимулирует выработку иммуноглобулинов [17].

Необходимо сказать, что кишечная палочка играет важную роль в организме человека. Она способна вырабатывать ряд витаминов (B₁, B₂, B₆, K и др.), жирные кислоты, участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных кислот и включена в процессы всасывания железа и кальция [3][5].

Показано, что E. coli продуцирует имеющее иммунологическое сходство с соматостатином вещество [16]. Также соматостатин продуцируется D-клетками тонкого кишечника, в то же время соматостатин-28 участвует в ингибировании инсулина, секретина, глюкагона, гастрина и других гормонов в желудочно-кишечном тракте. Основными функциями синтезированного в кишечнике соматостатина являются предотвращение секреции соляной кислоты, замедление перистальтики кишечника и изменение уровня желчных кислот [18].

В секрете толстого кишечника имеется значительное количество отторгнутых клеток эпителия, лимфоцитов и слизи, а также содержится небольшое количество ферментов. Либеркюнова железа (крипта), наряду с кишечными ворсинками, является одной из двух важнейших структурных единиц слизистой оболочки кишечника. На каждую ворсинку у человека приходится от 4 до 7 либеркюновых желез, максимальное их количество находится в 12-перстной кишке. Либеркюновы железы толстого кишечника выстланы однослойным цилиндрическим полярным эпителием, высота которого выше у устья, чем у основания. Эпителий либеркюновых желез содержит различные эндокринные клетки: I-клетки, продуцирующие холецистокинин (CCK), S-клетки — секретин (SCT), K-клетки — глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (GIP), M-клетки — мотилин (MLN), G-клетки — гастрин (GAST) [19]. Вышеперечисленные белки биохимически связаны между собой и с белком ACLY (АТФ-цитратлиаза), с уровнем которого коррелирует E. coli. Кроме того, ACLY и ряд дифференциально экспрессируемых генов участвуют в ErbB (эритобластический онкоген В) сигналинге и холецистокинин/гастрин сигналинге. ACLY является важным ферментом, связывающим углеводы с метаболизмом липидов путем выработки ацетил-КоА из цитрата для биосинтеза жирных кислот и холестерина [20]. Изменения уровней ACLY, вероятно, связаны с сигналингом гастрина.

Еще одним белком, оказывающим влияние на количество кишечной палочки, является MYH9 (немышечный миозин с тяжелой цепью IIa, член семейства моторных белков). MYH9 участвует в процессах секреции, цитокинезе и обеспечивает подвижность клеток. Количество E. coli отрицательно коррелирует с количеством данного белка в крови, что также может быть связано с сигналингом гастрина.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что повышение уровня ENO1 и снижение MYH9 и ACLY способствуют увеличению численности кишечной палочки. Гены ENO1, MYH9 и ACLY коэкспрессируются и участвуют в сигналинге гастрина. Гастрин, в свою очередь, связан с холецистокинином, секретином, глюкозозависимым инсулинотропным полипептидом и мотилином, которые вырабатываются либеркюновыми железами толстой кишки. При этом глюкозозависимый инсулинотропный полипептин (инкретин) тормозит абсорбцию жиров, что, вероятно, вызывает увеличение их количества в непереваренной пище и, как следствие, приводит к увеличению количества E. coli, для которой жирные кислоты являются одним из источников энергии [21]. Инкретин также ингибирует липопротеинлипазу. По данным R.A. Scholl et al., со снижением данного фермента коррелирует высокое количество E. coli [22].

Положительно коррелирующий с количеством кишечной палочки белок ENO1 стимулирует выработку иммуноглобулинов, что может свидетельствовать об усилении иммунной активности локально в толстом кишечнике. Одним из объяснений выявленной взаимосвязи может служить предположение, что аутологичная комменсальная микрофлора кишечника, вероятно, обладает толерантностью к местно выделяемым иммуноглобулинам. Аналогичная взаимосвязь отмечена и для другого облигатного представителя кишечной флоры — Lactobacillus spp. Суммируя вышесказанное: ENO1, MYH9 и ACLY тесно связаны с процессами экскреции биологически активных веществ клетками либеркюновых желез толстой кишки, в частности инкретина (GIP), который, в свою очередь, учитывая его функции, способствует увеличению численности кишечной палочки.

Белок DPP3 (дипептидилпептидаза 3) является цинк-зависимой пептидазой, внутриклеточной сериновой пептидазой и обладает участком уникальной каталитической последовательности, обеспечивающей деградацию олигопептидов с остатками от 4 до 10 аминокислот. Данный участок в нашем исследовании имел достаточно сильную отрицательную корреляционную связь с количеством кишечной палочки. Известно, что белок DPP3 имеет широкий спектр биологических функций. Так, он участвует во внутриклеточном расщеплении белков, кроме того, в некоторых исследованиях [23] была показана активность DPP3 в клетках врожденной иммунной системы, например в полиморфно-ядерных гранулоцитах и нейтрофилах, что отчасти подтверждает его активное участие в регуляции иммунной функции организма. Интересно отметить, что в нашем исследовании была выявлена сильная отрицательная корреляционная связь количества данного белка как с количеством кишечной палочки, так и с количеством гемолитических стафилококков.

В проведенном исследовании также было установлено, что уровень белка SPTA1 имел достаточно сильную отрицательную корреляцию с количеством кишечной палочки, однако, учитывая функции данного белка, возможные причины взаимодействия уровней данного белка и числа представителей E. coli остаются неясными.

Бифидобактерии являются одними из важнейших компонентов кишечной микрофлоры. Они участвуют в синтезе лактата и ацетата, регулирующих pH содержимого кишечника, а также обеспечивают усиление колонизационной резистентности кишечной микрофлоры.

В нашем исследовании наиболее сильные связи с количеством бифидобактерий в кишечнике были выявлены для белков EPB41, A1BG, VCP, C8B и CCT2, также слабая корреляционная связь установлена с количеством белков FAH и YWHAE.

Белок, кодируемый геном EPB41 (мембранный белок эритроцитов band 4.1), представляет собой многофункциональный протеин, который опосредует взаимодействия между цитоскелетом эритроцитов и плазматической мембраной. Кодируемый геном EPB41 белок связывает и стабилизирует дофаминовые рецепторы D2 и D3 на плазматической мембране нейронов, участвует в регуляции транспорта ионов кальция и регуляции кишечной абсорбции [24]. В проведенных исследованиях была установлена положительная корреляция между количеством белка EPB41 и количеством бифидобактерий. Отмечено, что при снижении количества белка EPB41 наблюдается нарушение всасывания кальция в клетках тонкого кишечника [23]. Таким образом, при увеличении количества белка EPB41 происходит усиление абсорбции кальция в эпителии тонкого кишечника. Аналогичный процесс контролируется и бифидобактериями, которые также вызывают усиление всасывания ионов кальция. Наибольшее количество Bifidobacterium spp. содержится в толстом отделе кишечника, в то же время бифидобактерии и лактобациллы составляют около 20–30% микрофлоры тонкого кишечника, локализуясь в основном в тощей кишке [25].

Одной из предполагаемых функций белка A1BG (альфа-1-B гликопротеин), экспрессирующегося в печени, является участие в распознавании клеток и регуляции клеточного поведения [26]. Для данного белка отмечена положительная корреляционная связь с количеством бифидобактерий, что может быть объяснено толерантностью иммунной системы в отношении КК и усилении иммунного ответа на фоне стрессового фактора, которым является «сухая» иммерсия. Важно отметить, что белок C8B (бета-цепь С8 комплемента, лектиновый путь активации), который также играет ключевую роль в реализации механизмов врожденного и адаптивного иммунного ответа, отрицательно коррелирует с количеством бифидобактерий в кишечнике.

Белок CCT2 (бета-субъединица белка 1-го Т-комплекса, молекулярный шаперон) способствует сворачиванию протеинов при гидролизе АТФ и в составе комплекса TRiC (шаперонин) играет роль в сворачивании актина и тубулина. Согласно данным литературы, спектриновый цитоскелет является мишенью для кишечных бактериальных патогенов (например, патогенных штаммов E. coli, S. Typhimurium, L. Monocytogene) за счет усиления адгезии клеток и играет решающую роль в прогрессировании дисбиотических состояний [27]. Вероятно, аналогичный механизм также позволяет усилить адгезию Bifidobacterium spp. на эпителии кишечника и таким образом способствовать их росту, поскольку в нашем исследовании была отмечена положительная корреляционная связь количества данного белка с количеством бифидобактерий.

В то же время YWHAE (белок активации тирозин-3-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы эпсилон), участвующий в регуляции широкого спектра как общих, так и специализированных сигнальных путей, также задействован в реализации различных биохимических процессов, связанных с передачей сигналов, таких как деление клеток и регуляция чувствительности к инсулину. Его уровень тесно связан с количеством белка HSF1 (фактор теплового шока 1), продукция которого клеткой, в свою очередь, индуцируется воздействием не только температурного стресса, но и множеством других провоцирующих факторов, а именно: гипоксических условий, воздействия ксенобиотиков, протеотоксического стресса [28]. Взаимосвязь уровней белка YWHAE в крови и количества Bifidobacterium spp. в кишечной флоре отрицательная. То есть при усилении воздействия стрессовых факторов и увеличении соответственно белка YWHAE в крови происходит угнетение роста бифидобактерий, что подтверждает взаимосвязь между уровнями стресса различной этиологии и кишечной флоры.

Белок FAH (фермент фумарилацетоацетат гидролаза, который расщепляет 4-фумарилацетоацетат до ацетоацетата и фумарата, обеспечивая финальную стадию катаболизма аминокислоты тирозина), как это следует из его основной функции, вовлечен в метаболизм тирозина и является последним из пяти ферментов, расщепляющих данную аминокислоту. Следствием действия этой гидролазы и превращения 4-фумарилацетоацетата в фумарат и ацетоацетат является повышение уровня кетоновых тел в крови. Было показано, что избыток кетоновых тел, например при кетодиете, снижает количество бифидобактерий, то есть между ними, по данным Q.Y. Ang, существует отрицательная корреляционная взаимосвязь [29]. В нашем эксперименте установлена прямая положительная корреляционная связь между количеством белка FAH и количеством Bifidobacterium spp., хотя степень выраженности ее была относительно слабой.

Вместе с тем белок VCP (валозин-содержащий белок) — АТФаза переходного эндоплазматического ретикулума является компонентом процесса деградации белков, связанного с эндоплазматической сетью и отвечающего за поддержание протеостаза клеток, в том числе эндотелия кишечника. Также в отдельных исследованиях было выдвинуто предположение о возможном вкладе белка VCP в течение инфекции, вызываемой токсоплазмой [30]. Данный белок положительно коррелирует с количеством бифидобактерий. Кроме того, он коэкспрессируется с белками CCT2 и YWHAE.

Лактобациллы играют важную роль в поддержании колонизационной резистентности желудочно-кишечного тракта. Несмотря на то что большинство бактерий в ЖКТ обитают в толстом кишечнике, лактобациллы и энтерококки являются доминирующей флорой в двенадцатиперстной и тощей кишке. Их количество по сравнению с толстой кишкой невелико (около 10³–10⁴ КОЕ/мл), однако они играют важную роль в иммуномодуляции и проявляют антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов [31].

Большинство штаммов Lactobacillus spp., заселяющих кишечник человека, являются гомоферментативными и образуют в качестве результата брожения преимущественно молочную кислоту, используя гликолиз для образования лактата из глюкозы. По отношению к кислороду большинство лактобацилл являются аэротолерантными анаэробами, то есть активнее всего растут при дефиците кислорода.

В нашем исследовании при анализе данных была выявлена взаимосвязь количества белков ENO1, CA2, S100A6 и HSPA4 с количеством лактобацилл. При этом ENO1 и CA2 имели положительную, а S100A6 и HSPA4 — отрицательную корреляционную связь с количеством Lactobacillus spp.

В некоторых исследованиях установлено, что ENO1 является белком, обеспечивающим толерантность клеток к гипоксии, а также катализирует превращение 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват в процессе гликолиза, причем присутствует как в клетках и тканях человека, так и у некоторых видов Lactobacillus spp. Вероятнее всего, взаимосвязь количества данного белка с количеством лактобацилл обусловлена в первую очередь увеличением толерантности клеток кишечника к гипоксии, которая, в свою очередь, способствует росту количества лактобацилл.

Белок CA2, принадлежащий к семейству карбоангидраз, играет решающую роль в функционировании гемоглобина благодаря катализу процесса гидратации углекислого газа с образованием угольной кислоты и последующей диссоциацией ее в воде. Это приводит к снижению pH крови, что, в свою очередь, снижает сродство гемоглобина к кислороду. Таким образом, увеличение количества данного белка также связано с гипоксией и, как следствие, с созданием наиболее благоприятных условий для размножения Lactobacillus spp.

Кальций-связывающий белок A6 S100A6 (S100) играет важную роль в связывании кальция. Уровень данного белка в крови отрицательно коррелирует с количеством лактобацилл (Lactobacillus spp.), которые в процессе метаболизма цитрата используют ионы кальция [32]. Следовательно, при увеличении количества белка S100A6 количество кальция, необходимого для метаболизма лактобацилл, снижается и уровень Lactobacillus spp. падает.

Установлено, что белок HSPA4 (член семейства белков теплового шока Hsp110) имеет важные функции молекулярного шаперона внутри клетки: ответ на развернутый белок, импорт белка во внешнюю мембрану митохондрий, сборка белковых комплексов. В условиях воздействия многих стрессовых факторов, вызывающих нарушение процессов протеостаза, также происходит и снижение комменсалов кишечника [33, 34]. В проведенных нами исследованиях корреляция количества данного белка с количеством Lactobacillus spp. была отрицательной: чем больше данного белка в крови, тем выше уровень стресса и тем меньше количество лактобацилл.

Энтерококки являются одним из важных компонентов микрофлоры кишечника. Ряд препаратов, применяемых в качестве пробиотиков в настоящее время, содержат Enterococcus faecium. Численность энтерококков в кишечнике в норме должна составлять 10⁶ КОЕ/мл. Энтерококки (вместе с лактобациллами), помимо толстого кишечника, колонизируют и тонкую кишку, однако их количество заметно меньше. Enterococcus spp. относят к молочнокислым микроорганизмам, так как они осуществляют метаболизм бродильного типа и ферментируют углеводы с образованием молочной кислоты, которая, в свою очередь, снижает pH среды. Кроме того, энтерококки являются хорошо известными продуцентами антимикробных пептидов (энтероцинов).

При анализе полученных данных была выявлена отрицательная корреляционная взаимосвязь белка CALM2 (кальмодулин) в крови с количеством энтерококков в кишечной флоре. Кальмодулин экспрессируется клетками эпителия практически во всех отделах тонкого кишечника и, вероятно, регулирует концентрацию свободного кальция в клетках микроворсинок. Имеются данные, что повышенное содержание ионов кальция и магния в среде ингибирует выработку энтероцинов и метаболизм энтерококков [35]. Это, вероятно, является одной из возможных причин отрицательной корреляции белка CALM2 в крови и количества Enterococcus spp. в кишечной флоре.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований были выявлены комплексы белков, уровень которых в крови хозяина коррелировал с количеством протективных микроорганизмов (ПМ).
2. Все белки, коррелирующие с разными ПМ, можно условно разделить на 4 группы в зависимости от функций и характера взаимодействия этих белков с различными микроорганизмами: белки, связанные с иммунной системой; белки, прямо или косвенно влияющие на процессы пищеварения и минеральный обмен; белки, влияющие на толерантность клеток к гипоксии; белки, имеющие высокий коэффициент регрессии при корреляции с некоторыми микроорганизмами, но не имеющие очевидной функциональной взаимосвязи.
3. Полученные данные способствуют не только фундаментальному пониманию взаимосвязи различных процессов в организме человека, но и могут послужить важной отправной точкой для формирования клинических рекомендаций по коррекции микрофлоры кишечника, основываясь на данных протеомного профиля крови или, напротив, коррекции белковых показателей крови с помощью пробиотических и аутопробиотических средств.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Д.В. Комиссарова — статистическая обработка результатов, написание разделов результаты, материалы и методы, обсуждение результатов, выводы; Л.Х. Пастушкова — дизайн экспериментальной части по протеомике, написание разделов введение, результаты и обсуждение результатов; Д.Н. Каширина — проведение экспериментальной части по протеомике, написание разделов введение, материалы и методы, обсуждение результатов; В.К. Ильин — дизайн и проведение экспериментальной части по микробиологии; И.М. Ларина — дизайн экспериментальной части по протеомике, написание разделов результаты, обсуждение результатов и выводы.