Определение предикторов неблагоприятного исхода заболевания у пациентов с COVID-19 на основании исследования системы гемостаза

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему времени установлено, что новая коронавирусная инфекция (COVID-19) характеризуется развитием эндотелиальной дисфункции, активацией клеток крови с образованием микрочастиц (МЧ) плазмы крови, несостоятельностью фибринолиза, развитием «цитокинового шторма» [1][2]. Подобные патологические изменения приводят к появлению прокоагулянтной направленности системы гемостаза, что может быть ассоциировано с развитием состояния гиперкоагуляции с последующим тромбообразованием в микроциркуляторном русле, дистресс-синдромом и полиорганной недостаточностью. Одной из ведущих причин увеличения смертности у пациентов с COVID-19 являются тромбоэмболические осложнения.

Показано, что у больных, которые проходят лечение в отделениях реанимации и/или интенсивной терапии, частота тромботических осложнений достигает 18% [3][4]. На фоне новой коронавирусной инфекции происходит активация системы гемостаза, охватывающая как ее плазменное, так и клеточное звено, что и приводит к развитию протромботического состояния [5–8]. Большую роль в развитии данных прокоагулянтных изменений могут играть МЧ, происходящие из различных клеток крови и способные участвовать в целом ряде биологических реакций организма. МЧ плазмы крови — фосфолипидные микровезикулы, размер которых колеблется в диапазоне 0,1–1 мкм. МЧ окружены клеточной мембраной, лишены ядра и значительно различаются по составу антигенных детерминант, которые находятся на их поверхности, что определяется как механизмом образования МЧ, так и характером стимулирующего влияния. За счет локализованных на их поверхности отрицательно заряженных фосфолипидов и тканевого фактора МЧ активно участвуют в гемостатических реакциях, что может иметь значение в процессе развития тромботических осложнений при различной патологии, в том числе и на фоне COVID-19 [9–11].

Использование различных лабораторных и инструментальных исследований для поиска предикторов неблагоприятного течения и исхода новой коронавирусной инфекции представляет большой интерес. Так, определение вирусной нагрузки SARS-CoV-2, оценка результатов компьютерной томографии легких при поступлении в стационар с помощью искусственного интеллекта обнаружили хорошее прогностическое значение, однако эти методы недоступны для широкого клинического применения [12, 13] Определенной информативностью обладают уровень лимфопении и изменений субпопуляции лимфоцитов, а также изменение таких показателей, как С-реактивный белок, прокальцитонин и ферритин, которые являются неспецифическими маркерами воспаления [14–17]. Учитывая характерные изменения системы свертывания крови, сопровождающие COVID-19, поиск подобных маркеров проводится и среди гемостатических показателей. Многие исследователи отмечают связь высокого уровня D-димера с летальным исходом, при этом его пороговые прогностические значения сильно варьируют [18–20].

Выбор показателей, характеризующих состояние плазменного гемостаза, а также степень активации клеток крови, которые могут служить для прогностической оценки тяжести течения заболевания и его исхода, будет способствовать более рациональному ведению пациентов с COVID-19.

Цель исследования — выявить предикторы неблагоприятного исхода новой коронавирусной инфекции на основе оценки параметров, характеризующих состояние системы гемостаза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследованная группа включала 163 пациента (78 мужчин и 85 женщин, возраст которых 35–90 лет, медиана возраста — 69 лет), которые находились на лечении в отделении интенсивной терапии с тяжелой или среднетяжелой формой COVID-19. Критериями включения в настоящее исследование служили: возраст старше 18 лет, новая коронавирусная инфекция, подтвержденная положительным результатом лабораторного исследования на наличие РНК вируса SARS-CoV-2. Критерии исключения из группы пациентов составили: возраст менее 18 лет, наличие в анамнезе или на момент обследования онкологического заболевания, ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С, патологии печени с нарушением ее функции, заболеваний почек с изменением скорости клубочковой фильтрации, прием каких-либо препаратов антикоагулянтного действия на постоянной основе до начала заболевания.

Тяжесть течения заболевания была обусловлена степенью поражения легких, которая составляла более 25%, а также коморбидностью пациентов. Среди обследованных больных у 120 (74%) пациентов заболевание закончилось выздоровлением, у 43 (26%) пациентов наблюдался неблагоприятный (летальный) исход заболевания. В зависимости от исхода заболевания пациенты были разделены на две группы, в которых проводилась оценка показателей гемостаза и характеристик МЧ: группа «выжившие пациенты» (n = 120); группа «умершие пациенты» (n = 43).

Взятие образцов крови для исследования проводили (при поступлении пациентов в стационар до назначения специфической терапии и антикоагулянтной профилактики) с помощью вакуумной системы в вакуумные пробирки Vacutest с антикоагулянтом 3,2% цитрат натрия.

Оценивали следующие параметры, характеризующие состояние плазменного гемостаза: протромбиновый тест по Квику (ПТ), концентрацию фибриногена (ФГ), активированное парциальное тромбопластиновое время (индекс АПТВ), активность фактора VIII (ф.VIII), ристоцетин-кофакторную активность и содержание фактора Виллебранда (ф.В. и аг.ф.В. соответственно), активность протеина С (PC) и антитромбина (АТ), а также содержание свободного протеина S (PS). Использовали реагенты HemosIL (Instrumentation Laboratory, США), все исследования проводили согласно инструкциям производителя к реагентам и оборудованию. Определение перечисленных параметров осуществляли на автоматических коагулометрах серии ACL: ACL Top 300 CTS и ACL Elite Pro (Automated Coagulation Laboratory, Instrumentation Laboratory, США).

Для изучения характеристик МЧ на проточном цитофлуориметре бедную тромбоцитами плазму центрифугировали на центрифуге ThermoFisherScientific (Германия) при температуре 22 °С в течение 30 мин при ускорении 14 000 g. Из образцов, полученных после высокоскоростного центрифугирования, аспирировали супернатант и забирали осадок, который ресуспендировали путем добавления 100 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Полученную взвесь МЧ использовали для дальнейшего исследования. Для определения количества и происхождения МЧ применяли лазерный проточный цитофлуориметр Cytoflex (Beckman Coulter, США) с использованием флуоресцентно меченых антител к поверхностным маркерам клеток: тромбоцитарных — CD41, лейкоцитарных — CD45, эндотелиальных — CD144.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью пакета программного обеспечения Statistica 12.0 (StatSoft Inc., США). Несимметричное распределение полученных данных выявляли с помощью критерия Шапиро – Уилка, в связи с чем полученные результаты представлены в виде медианы (М_е) и межквартильного [ 25–75 процентили] интервала [Q₁–Q₃]. Сравнение двух групп проводили с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни. Для поиска разделяющего порога переменных, ассоциированных с неблагоприятным исходом COVID-19, был использован ROС-анализ с построением ROC-кривых. Количественную интерпретацию ROC-кривых оценивали по показателю AUC, площади, ограниченной ROC-кривыми и осью доли ложноположительных результатов теста. Значение общей чувствительности модели по AUC менее 0,5 демонстрировало непригодность выбранного метода классификации, тогда как показатель AUC более 0,7 характеризовал высокую прогностическую силу построенной модели. В качестве критерия нахождения оптимальной пороговой точки или разделяющего значения по кривой ROC использовали индекс Юдена, который позволил оценить разницу между долей истинно положительных результатов теста (чувствительность) и долей ложноположительных результатов теста (специфичность) и выбрать оптимальное пороговое значение. Критический уровень статистической значимости принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты, полученные при сравнении показателей плазменного гемостаза обследованных пациентов в зависимости от исхода заболевания, представлены в таблице 1.

Результаты, представленные в таблице 1, указывают на наличие значимых различий между двумя группами обследованных пациентов: неблагоприятный исход заболевания ассоциировался с увеличением активности ф.В. в 1,4 раза (340,0 [ 260,1–420,0]; p = 0,01), снижением показателей ПТ по Квику в 1,2 раза (65,3 [ 51,0–73,9]; p = 0,00) и активности АТ до уровня 85,3 [ 71,0–97,5]; (p = 0,034) при сравнении с группой выживших пациентов. Наиболее значимые различия затрагивали концентрацию D-димера, которая у умерших пациентов была превышена практически в 4 раза (1670,0 [ 715,0–4334,5]; p ≤ 0,0001) относительно уровней у больных с благоприятным исходом заболевания. Полученный результат согласуется с данными других исследователей, которые также рассматривали значительное повышение уровня D-димера в качестве неблагоприятного маркера течения и исхода новой коронавирусной инфекции [21][22].

Параллельно с исследованием параметров плазменного гемостаза нами был проведен анализ характеристик МЧ плазмы крови у части обследованных пациентов в зависимости от исхода заболевания. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о значимом повышении числа тромбоцитарных МЧ у больных с неблагоприятным исходом заболевания по сравнению с выжившими пациентами. Значимых различий между двумя группами по количеству эндотелиальных МЧ выявлено не было. Лейкоцитарные МЧ были обнаружены в незначительном количестве, что не позволило провести корректную статистическую обработку результатов.

Для дальнейшего анализа были отобраны результаты тех тестов, параметры которых значимо различались в группах пациентов в зависимости от исхода заболевания, а именно концентрация D-димера, активность ф. Виллебранда и АТ, ПТ по Квику, число тромбоцитарных МЧ.

Оценка с помощью ROС-анализа показателей активности ф.В., антитромбина с вероятностью развития неблагоприятного исхода COVID-19 не дала возможности получить модель хорошего качества. В то же время при проведении ROС-анализа для таких параметров, как D-димер, ПТ по Квику и количество тромбоцитарных МЧ, изменения которых также непосредственно связаны с неблагоприятным исходом COVID-19, была получена модель с высокой прогностической силой: AUC составила 0,787, 0,747 и 0,798 соответственно. Полученные результаты позволили определить пороговые значения данных показателей, указывающие на высокую вероятность летального исхода.

При анализе уровня D-димера наибольший индекс Юдена — 47,2, соответствующий чувствительности 72% и специфичности 75,2%, был получен для пороговой точки 800 нг/мл (рис. 1).

Для показателя ПТ по Квику наибольший индекс Юдена — 44,3, соответствующий чувствительности модели 70% и специфичности 74,3%, был получен для пороговой точки 70% (рис. 2).

Для числа тромбоцитарных МЧ наибольший индекс Юдена — 50,5, соответствующий чувствительности 77,8% и специфичности 72,7%, был получен для пороговой точки 3,22% событий (рис. 3).

Таким образом, проведенный анализ чувствительности и специфичности выбранных параметров позволяет рассматривать снижение ПТ по Квику менее 70%, повышение уровня D-димера более 800 нг/мл и количества тромбоцитарных МЧ более 3,22% событий в качестве маркеров неблагоприятного исхода СOVID-19.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нарушения системы гемостаза играют одну из ведущих ролей в патогенезе осложнений COVID-19. Протромботические изменения приводят к развитию процессов тромбообразования в сосудах различного типа и калибра, что ухудшает прогноз заболевания. Проведенное нами исследование обнаружило, что ряд показателей, характеризующих состояние системы гемостаза, а именно концентрация D-димера и ПТ по Квику, могут быть использованы в качестве лабораторных предикторов летального исхода заболевания. Учитывая немногочисленность группы, в которой определялись характеристики МЧ, требуются дополнительные исследования для определения их значения для развития неблагоприятного течения и исхода COVID-19.